舍曲林對(duì)腸易激綜合征大鼠cAMP/PKA通路及腸道炎癥反應(yīng)的影響①

范紅云 段志英 趙亞男 楊春春 楊明月 張 梅 霍曉輝 白 云 王 競(jìng)（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊 050031）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是最常見(jiàn)胃腸道疾病之一，在多數(shù)國(guó)家成年人中發(fā)病率高達(dá)10%～20%，以慢性或復(fù)發(fā)性腹痛、腹瀉、排便習(xí)慣和大便性狀異常為主要癥狀，尚無(wú)特異性治療方案，嚴(yán)重威脅患者生活質(zhì)量和生命健康［1-2］。舍曲林為抗抑郁藥物，隨著對(duì)其藥理作用的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)IBS治療效果良好，且安全性較高［3］。舍曲林和去甲替林聯(lián)合作用可保護(hù)由氧化應(yīng)激引起的大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷［4］。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/環(huán)磷酸腺苷依賴性蛋白激酶A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA）是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典途徑之一，在介導(dǎo)細(xì)胞各種刺激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)受體、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)生物細(xì)胞活性。IBS 可通過(guò)cAMP/PKA 途徑調(diào)節(jié)炎癥因子釋放、免疫系統(tǒng)激活和液態(tài)水代謝異常［5］。但舍曲林對(duì)IBS 大鼠cAMP/PKA 通路及腸道炎癥反應(yīng)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用母嬰分離加醋酸灌腸聯(lián)合結(jié)直腸擴(kuò)張刺激法制備大鼠IBS 模型，并給予舍曲林治療，旨在從cAMP/PKA 通路揭示舍曲林對(duì)IBS 大鼠腸道炎癥反應(yīng)的影響，為IBS治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar 孕鼠8 窩購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》并通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷照顧。飼養(yǎng)條件：22℃，55%濕度，12 h光/12 h暗循環(huán)。

1.1.2 主要試劑和儀器 舍曲林（50 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：H20051553）購(gòu)自輝瑞制藥有限公司；匹維溴銨（50 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：H20120127）購(gòu)自法國(guó)得舒特公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和β-actin 鼠抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白提取試劑盒、ECL 顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；cAMP、PKA、CREB、p-CREB 鼠抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；酶標(biāo)儀Fax-20100 購(gòu)自美國(guó)INStat 公司；尼康SMZ745 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海普赫生物科技有限公司；蛋白凝膠成像儀、轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)和染色機(jī)均購(gòu)自湖北惠達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IBS大鼠模型構(gòu)建與分組 采用覃穎等［6］母嬰分離加醋酸灌腸聯(lián)合結(jié)直腸擴(kuò)張刺激法構(gòu)建大鼠IBS模型：幼年大鼠出生后第2～21天每日進(jìn)行3 h母子分離；幼年大鼠出生后第8～21天將經(jīng)石蠟潤(rùn)滑后直徑為1 mm 的中心靜脈導(dǎo)管緩慢插入幼鼠肛門(mén)約2 mm處，0.5%醋酸灌腸，隨著日齡增長(zhǎng)灌注量逐漸增加，其中第8～10 天灌注0.2 ml，第11～12 天灌注0.3 ml，第13～15 天灌注0.4 ml，第16～17 天灌注0.5 ml，第18～19 天灌 注0.6 ml，第20～21 天灌 注0.7 ml；第22～24 天不進(jìn)行任何干擾；當(dāng)幼鼠發(fā)育至25 d 時(shí)，母子分籠正常飼養(yǎng)；幼鼠發(fā)育至42 d 時(shí)，給予1 次結(jié)直腸擴(kuò)張刺激：將經(jīng)石蠟潤(rùn)滑后的6F 導(dǎo)尿管插入大鼠肛門(mén)6～7 cm 處后固定，待大鼠適應(yīng)后，均勻緩慢向?qū)蚬苤凶⑷?.5 ml蒸餾水（0.5 ml/min）以擴(kuò)張結(jié)直腸并維持30 s，使大鼠腹部抬起，為提高造模成功率和模型穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次間隔5 min；將大鼠正常飼喂至8 周齡。根據(jù)其糞便和行為學(xué)進(jìn)行篩選：當(dāng)大鼠腹瀉且精神狀態(tài)與正常大鼠存在明顯差異時(shí)，表明模型制備成功［7］。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、舍曲林低、中、高劑量（10、20、30 mg/kg）組［8］、陽(yáng)性對(duì)照組（匹維溴銨，2 mg/kg）［9］，每組15只，另取15只正常大鼠作為對(duì)照組。大鼠發(fā)育至9 周齡時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水，其他各組給予相應(yīng)藥物，2次/d，連續(xù)10 d，10 ml/kg。

1.2.2 各組大鼠一般情況、糞便含水量和排便時(shí)間 大鼠給藥結(jié)束12 h 內(nèi)，觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食、行為活動(dòng)等一般情況并記錄，各組大鼠提尾，進(jìn)行排便刺激，離心管采集大鼠糞便，稱重記錄，同時(shí)記錄排便時(shí)間，大鼠糞便烘干后再次稱重并記錄，計(jì)算大鼠糞便含水率。

1.2.3 腹部撤回反射（abdominal withdrawal reflex，AWF）評(píng)分法檢測(cè)大鼠內(nèi)臟敏感性 對(duì)各組大鼠持續(xù)進(jìn)行提尾刺激，使其排盡糞便后，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）輕度麻醉，將經(jīng)石蠟潤(rùn)滑后帶球囊且未充氣的導(dǎo)管從大鼠肛門(mén)緩慢插入，使球囊末端距肛門(mén)約1 cm 處并固定于大鼠尾根部。每只大鼠給予球囊擴(kuò)張3 次，擴(kuò)張容量分別為1.0、1.5、2.0 ml，每次擴(kuò)張持續(xù)30 s，重復(fù)3 次，根據(jù)AWF 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（0 分：大鼠情緒基本穩(wěn)定，未出現(xiàn)敏感現(xiàn)象；1 分：大鼠情緒變得不穩(wěn)定，偶爾扭轉(zhuǎn)頭部；2 分：大鼠腹背部肌肉輕微收縮，但腹部未抬離地面；3 分：大鼠腹背部肌肉較強(qiáng)烈收縮，腹部抬離地面；4 分：大鼠腹背部肌肉強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形，腹部和會(huì)陰部均抬離地面）取平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分值越高表明大鼠內(nèi)臟敏感性越強(qiáng)。

1.2.4 HE 染色觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 1.2.2和1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）深度麻醉后處死大鼠，分離大鼠結(jié)腸組織，每組取5只大鼠結(jié)腸組織（其余大鼠結(jié)腸組織迅速置于-80℃冰箱用于ELISA 和Western blot檢測(cè)），4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，為使組織切片與載玻片貼合更緊密，需在60℃下烤片2 h，依次切片，脫蠟入水，染色，30℃烘干30 min，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP 含量取1.2.4中置于-80℃冰箱中的大鼠結(jié)腸組織，每組0.05 g，低溫融化，加入9 倍體積預(yù)冷后的PBS 勻漿，13 000 r/min 離 心15 min，取上清，按照IL-1β、TNF-α、IL-6 和cAMP ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達(dá) 取1.2.4 中置于-80℃冰箱中的各組大鼠剩余結(jié)腸組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，抗體封閉，加入1∶2 000 稀釋后的cAMP、PKA、CREB 和p-CREB 鼠抗4℃孵育過(guò)夜，含辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL 顯色，凝膠成像儀拍照，以β-actin 為參照，分析灰度值，得到蛋白表達(dá)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舍曲林對(duì)IBS 大鼠一般情況、排便時(shí)間和糞便含水量的影響 對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，發(fā)育正常，皮毛光亮。與對(duì)照組相比，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，情緒煩躁易怒，活動(dòng)較少，排便時(shí)間顯著縮短（P＜0.05），糞便含水量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠異常狀態(tài)逐漸改善，排便時(shí)間依次延長(zhǎng)（P＜0.05），糞便含水量依次降低（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠排便時(shí)間及糞便含水率比較（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

表1 各組大鼠排便時(shí)間及糞便含水率比較（，n=15）Tab.1 Comparison of defecation time and fecal water content of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.2 舍曲林對(duì)IBS大鼠內(nèi)臟敏感性的影響 如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠內(nèi)臟敏感性顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠內(nèi)臟敏感性依次降低（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠內(nèi)臟敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠內(nèi)臟敏感性比較（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

表2 各組大鼠內(nèi)臟敏感性比較（，n=15，分）Tab.2 Comparison of visceral sensitivity of rats in each group（，n=15，score）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.3 舍曲林對(duì)IBS 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響 對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥因子浸潤(rùn)；模型組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯水腫，腸黏膜完整性受損，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；舍曲林低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織水腫逐漸消除，腸黏膜趨于完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少；舍曲林高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化無(wú)顯著差異（圖1）。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)HE染色（×200）Fig.1 HE staining of colon tissue pathology of rats in each group（×200）

2.4 舍曲林對(duì)IBS 大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量的影響 如表3 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著升高，cAMP 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量依次降低，cAMP 含量依次升高（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和cAMP 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比較（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和cAMP含量比較（，n=15）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cAMP levels in colonic tissue of rats in each group（，n=15）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

2.5 舍曲林對(duì)IBS 大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB 磷酸化水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB 磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，舍曲林低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB 磷酸化水平依次升高（P＜0.05）；舍曲林高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB 磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2、表4）。

圖2 各組大鼠cAMP、PKA和CREB蛋白表達(dá)Fig.2 cAMP，PKA and CREB protein expressions of rats in each group

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB磷酸化水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB磷酸化水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of cAMP，PKA protein expressions and CREB phosphorylation level in colon tissue of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05；compared with Sertraline low dose，3）P＜0.05；compared with Sertraline medium dose，4）P＜0.05.

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活習(xí)慣改變，IBS發(fā)病率不斷上升，但其產(chǎn)生的病因尚不明確，由于IBS 并發(fā)抑郁和焦慮的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此，精神心理異常和腸道刺激因素可能是產(chǎn)生IBS 的主要因素，其中心理應(yīng)激與IBS 發(fā)生和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［10］。IBS 發(fā)病機(jī)制可能由于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生，進(jìn)而降低結(jié)腸收縮性，從而導(dǎo)致結(jié)腸損傷［11］。本研究采用母嬰分離加醋酸灌腸聯(lián)合結(jié)直腸擴(kuò)張刺激法制備大鼠IBS 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠精神狀態(tài)較差，情緒煩躁易怒，活動(dòng)較少，結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯水腫，結(jié)腸黏膜完整性受損，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，排便時(shí)間和結(jié)腸組織中cAMP 含量顯著降低（P＜0.05），糞便含水量、內(nèi)臟敏感性、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著升高（P＜0.05），提示IBS大鼠模型構(gòu)建成功，且產(chǎn)生結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)。

舍曲林主要用于治療抑郁癥相關(guān)疾病，包括焦慮癥、狂躁癥等，且能有效防止癥狀復(fù)發(fā)，具有較高的安全性和耐受性。隨著對(duì)其藥理作用的不斷研究，發(fā)現(xiàn)給予潰瘍性結(jié)腸炎伴抑郁患者鹽酸舍曲林聯(lián)合美沙拉秦治療后，可有效緩解患者抑郁癥狀，且能改善潰瘍性結(jié)腸炎［12］。焦慮患者經(jīng)舍曲林治療后，其促炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-6、IL-8 含量顯著下降［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)舍曲林干預(yù)后，IBS 大鼠不良癥狀逐漸緩解，排便時(shí)間、cAMP 含量顯著升高（P＜0.05），糞便含水量、內(nèi)臟敏感性、TNF-α、IL-1β和IL-6 含量顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，提示舍曲林可能通過(guò)減輕結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)緩解大鼠IBS，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

cAMP/PKA 信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)與相應(yīng)受體結(jié)合，調(diào)控第二信使cAMP 水平，引發(fā)下游事件，主要過(guò)程是通過(guò)活化cAMP 依賴的PKA 導(dǎo)致下游靶蛋白磷酸化，從而影響細(xì)胞代謝和行為，使細(xì)胞快速應(yīng)答胞外信號(hào)。王瑩等［15］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胃腸組織基于cAMP/PKA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化與大鼠脾氣虛證模型顯著相關(guān)。YU 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過(guò)激活腸-腦軸中5-羥色胺依賴的PKA/CREB 信號(hào)，改善IBS引起的抑郁、焦慮、內(nèi)臟超敏和腸道運(yùn)動(dòng)異常等癥狀。LI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽通過(guò)上調(diào)cAMP/PKA 信號(hào)通路調(diào)節(jié)星形細(xì)胞極化，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)非酒精性脂肪肝。結(jié)直腸癌中，激活cAMP/PKA 通路可抑制腫瘤血管生成和血管生成擬態(tài)［18］。磷酸二酯酶抑制劑可通過(guò)cAMP/PKA/CREB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗炎作用逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶缺陷［19］。另外，木犀草素可能通過(guò)PKA 改善IBS［20］。而PKA 蛋白激酶信號(hào)通路參與應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的內(nèi)臟敏感性［21］。本研究發(fā)現(xiàn)舍曲林可顯著提高大鼠結(jié)腸組織cAMP、PKA 蛋白表達(dá)及CREB 磷酸化水平，提示舍曲林可能通過(guò)上調(diào)cAMP/PKA 通路減輕大鼠腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩大鼠IBS發(fā)展。

綜上所述，舍曲林可能通過(guò)劑量依賴性上調(diào)cAMP/PKA 通路減輕大鼠腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩IBS 發(fā)展，為臨床舍曲林治療IBS 提供了依據(jù)，但舍曲林對(duì)IBS的作用機(jī)制十分復(fù)雜，尚需深入研究。