急性熱應(yīng)激對(duì)睪丸免疫微環(huán)境相關(guān)蛋白的影響①

胡素芹 胡 珂 劉殿龍 李春蕊 許亞輝 崔力丹 郭 ?。ū本┲嗅t(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 102488）

近年來(lái)，男性生殖健康一直被廣泛關(guān)注。研究證實(shí)，環(huán)境因素顯著影響精子數(shù)量和質(zhì)量，嚴(yán)重阻礙男性生殖功能［1-2］。陰囊溫度時(shí)常會(huì)受到自身坐勢(shì)、穿著、生活方式、職業(yè)等外部因素的影響［3］。在眾多環(huán)境影響因素中，盡管睪丸熱應(yīng)激被證明是男性生育能力降低的主要危害之一，但卻最易被忽略［4-5］。此外，隨著全球氣候變暖，有害物質(zhì)的不利影響將逐漸惡化［6］。

睪丸是典型的免疫豁免組織，具有特殊的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，該機(jī)制在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。免疫豁免和免疫防御兩方面協(xié)調(diào)存在，共同維持了正常的睪丸免疫微環(huán)境平衡［7］。當(dāng)這種免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，睪丸就會(huì)發(fā)生炎癥并損害精子發(fā)生過(guò)程，影響男性生殖功能。血睪屏障由睪丸支持細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間緊密連接、縫隙連接和錨定連接構(gòu)成，是執(zhí)行免疫豁免功能的天然物理屏障，其嚴(yán)格限制分子和細(xì)胞通過(guò)，阻止病原微生物或抗原的侵襲，同時(shí)可阻止循環(huán)中的抗體進(jìn)入生殖道管腔，避免因免疫應(yīng)答或炎癥反應(yīng)造成局部損傷，為精子發(fā)生提供了適宜的免疫微環(huán)境［8-9］。血睪屏障的破壞可導(dǎo)致免疫豁免功能的破壞，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體自身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致不育［10］。而高溫對(duì)睪丸內(nèi)免疫微環(huán)境的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察急性熱應(yīng)激后不同時(shí)間睪丸內(nèi)血睪屏障相關(guān)分子及經(jīng)典炎癥通路NF-κB 信號(hào)通路的變化，進(jìn)而探討熱應(yīng)激對(duì)睪丸免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠49 只，8 周齡，體質(zhì)量310～340 g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜節(jié)律每12 h 交替，自由飲水和進(jìn)食，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；甲醇（北京化工廠(chǎng)）；中性裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白磷酸酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、30%丙烯酰胺、10×TBST、山羊抗兔IgG（H+L）Biotin-conjugated、過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶親和素（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；TEMED（BioRule 公司）；Page Ruler Prestained Protein Ladder（Thermo Scientific 公司）；PVDF 膜（美國(guó)millipore 公司）；兔抗大鼠Vimentin、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、IκBα、phospho-IκBα單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；兔抗大鼠occludin、β-actin 多克隆抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；兔抗大鼠ZO-1 單克隆抗體（美國(guó)賽默飛invitrogin 公司）；IL-1β ELISA 試劑盒（美國(guó)Raybiotech公司）。

1.1.3 主要儀器 SSW-420-2S 恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）；VCX150 超聲破碎儀（美國(guó)SONICS 公司）；Mini Trans-Blot cell 電泳槽、ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng)、iMark 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 SD 大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，即1個(gè)對(duì)照組和6個(gè)熱應(yīng)激組（0.5 h組、2 h組、4 h 組、6 h 組、24 h 組和48 h 組），7 只/組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，除對(duì)照組以外，其余6 組大鼠用2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，43℃恒溫水浴20 min，并分別于水浴結(jié)束后0.5 h、2 h、4 h、6 h、24 h 和48 h的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)摘取睪丸，-80℃冰箱凍存。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)大鼠睪丸內(nèi)蛋白表達(dá)變化 睪丸組織加入適量PMSF、磷酸酶抑制劑和中性裂解液并研磨破碎，以12 000 r/min 低溫離心5 min，收集上清液。BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，100℃煮沸5 min 進(jìn)行蛋白變性。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜（孔徑0.45 μm）。PVDF 膜用5%BCA 封閉液室溫封閉1.5 h，而后用1%BCA 稀釋的一抗孵育，4℃過(guò)夜。第2 天PVDF 膜室溫?fù)u床0.5 h，TBST 清洗4 次，5 min/次。PVDF 膜放入山羊抗兔IgG（H+L）Biotin conjugated 溶液（TBST 稀釋?zhuān)?∶1 000），37℃孵育1.5 h。TBST 洗膜5 min×4 次，過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶親和素溶液（TBST 稀釋?zhuān)?∶1 000）37℃孵育0.5 h。TBST 洗膜5 min×4 次后，PVDF 膜上加ECL 發(fā)光液反應(yīng)1～3 min，然后置于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)，所得圖片使用Image J軟件分析，檢測(cè)各條帶的灰度值。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠睪丸內(nèi)IL-1β表達(dá) 采用ELISA法檢測(cè)睪丸組織內(nèi)IL-1β的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。微孔板用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔OD 值，450 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm 為參考波長(zhǎng)。所得OD 值用ELISA Cal 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各組IL-1β濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示。方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性熱應(yīng)激下調(diào)睪丸內(nèi)波形蛋白vimentin 及血睪屏障緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1表達(dá)與對(duì)照組相比，6個(gè)熱應(yīng)激組大鼠睪丸內(nèi)vimentin和occludin 的表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；除0.5 h 組外，其余熱應(yīng)激組ZO-1表達(dá)相較于對(duì)照組均顯著降低（P＜0.01），如圖1。

圖1 各組大鼠睪丸內(nèi)vimentin、occludin和ZO-1表達(dá)Fig.1 Expressions of vimentin，occludin and ZO-1 in testis of rats in each group

2.2 急性熱應(yīng)激上調(diào)睪丸內(nèi)NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá) 與對(duì)照組相比，0.5 h 組、2 h 組和4 h組p-NF-κB p65 及p-IκBα 表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），6 h 組、24 h 組和48 h 組p-NF-κB p65及p-IκBα的表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），如圖2。

圖2 各組大鼠睪丸內(nèi)p-NF-κB p65和p-IκBα表達(dá)Fig.2 Expressions of p-NF-κB p65 and p-IκBα in testis of rats in each group

2.3 急性熱應(yīng)激后睪丸內(nèi)IL-1β 的表達(dá) 與對(duì)照組相比，24 h 和48 h 熱應(yīng)激組大鼠睪丸內(nèi)IL-1β 表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1、圖3。

表1 各組大鼠睪丸組織內(nèi)IL-1β的表達(dá)（，n=6）Tab.1 Expression of IL-1β in testis of rats in each group（，n=6）

表1 各組大鼠睪丸組織內(nèi)IL-1β的表達(dá)（，n=6）Tab.1 Expression of IL-1β in testis of rats in each group（，n=6）

圖3 大鼠睪丸內(nèi)IL-1β的表達(dá)變化Fig.3 Expression change of IL-1β in testis of rats

3 討論

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，會(huì)產(chǎn)生抗原性蛋白卻并未誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，這有賴(lài)于睪丸特殊的免疫微環(huán)境和免疫調(diào)節(jié)功能［11］。血睪屏障作為天然物理屏障，在睪丸的免疫豁免功能中發(fā)揮重要作用［12-13］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸復(fù)方及枸杞多糖，菟絲子黃酮可有效干預(yù)熱應(yīng)激后導(dǎo)致的血睪屏障破壞及生精細(xì)胞的凋亡［14-16］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可誘發(fā)機(jī)體各種炎癥反應(yīng)［17-19］。因此推測(cè)急性熱應(yīng)激會(huì)引起睪丸內(nèi)免疫微環(huán)境變化，該變化可能誘發(fā)了炎癥反應(yīng)。

血睪屏障由多種支持細(xì)胞膜蛋白（如ZO-1、occludin 和claudins）組成，是睪丸免疫耐受的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［20］。其可限制大分子物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)通過(guò)細(xì)胞間隙，確保曲細(xì)精管與間質(zhì)內(nèi)的環(huán)境顯著不同，并為生精細(xì)胞的正常發(fā)育創(chuàng)造了獨(dú)特的環(huán)境，保證生精細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的影響［21］。一旦緊密連接結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)缺失，破壞了睪丸的免疫豁免屏障，則有可能導(dǎo)致自身免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生［22］。而vimentin 出現(xiàn)在支持細(xì)胞的基底和核周區(qū)域，并向頂端細(xì)胞質(zhì)輻射，負(fù)責(zé)將生精細(xì)胞錨定到生精上皮［23］。與血睪屏障共同維持睪丸的免疫豁免環(huán)境。vimentin 塌陷會(huì)破壞生精上皮結(jié)構(gòu)的完整性，造成生精細(xì)胞脫落、凋亡［24］。本研究結(jié)果表明急性熱應(yīng)激后0.5 h 即出現(xiàn)睪丸內(nèi)生精上皮結(jié)構(gòu)和血睪屏障通透性被破壞，并且熱應(yīng)激后48 h 內(nèi)破壞程度隨著時(shí)間的增長(zhǎng)有增強(qiáng)的趨勢(shì)。提示急性熱應(yīng)激生精障礙早期干預(yù)治療對(duì)減輕睪丸組織損傷十分關(guān)鍵。

NF-κB p65 是存在于胞漿中的一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與并調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB p65 與IκBα 相結(jié)合，以聚合物的形式存在于胞漿內(nèi)，無(wú)轉(zhuǎn)錄活性［25］。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，IκBα 磷酸化，隨即從聚合體中解離，再經(jīng)泛素化修飾后，IκBα 發(fā)生降解［26-27］。而受到IκBα 抑制的NF-κB p65 得以解離并迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)生磷酸化并誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（如IL-1、TNF-α、IL-6等）［28］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明急性熱應(yīng)激6 h 以后NF-κB 信號(hào)通路才被激活，其中24 h 和48 h 差異最顯著。因此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)熱應(yīng)激大鼠睪丸內(nèi)IL-1β 的表達(dá)變化。IL-1β 是由NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控的下游重要炎癥相關(guān)因子之一，能夠阻遏睪酮合成蛋白酶基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，阻礙精子發(fā)生，降低精子活力，減少精子數(shù)量，從而導(dǎo)致不育［29-30］。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然NF-κB 信號(hào)通路被激活，但睪丸內(nèi)炎癥因子卻沒(méi)有增多，并未發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)。這可能是因?yàn)椴G丸內(nèi)免疫豁免功能由多種具有免疫抑制功能的細(xì)胞和復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)共同構(gòu)成和調(diào)節(jié)［7，31］。急性熱應(yīng)激的刺激程度未超出睪丸免疫抑制的調(diào)節(jié)范圍。

綜上所述，本研究結(jié)果表明急性熱應(yīng)激在早期即可破壞睪丸內(nèi)血睪屏障及生精上皮結(jié)構(gòu)，破壞睪丸免疫豁免的屏障，同時(shí)在中期即激活NF-κB 信號(hào)通路。但該熱激刺激并未導(dǎo)致下游炎癥因子增多，未誘發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究表明，持續(xù)性的熱刺激更能誘發(fā)睪丸產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)和相應(yīng)的炎癥損傷［32-33］。熱應(yīng)激誘發(fā)睪丸局部炎癥反應(yīng)需要時(shí)間界點(diǎn)和溫度閾值。因此，繼續(xù)加大熱刺激程度觀(guān)察睪丸內(nèi)免疫微環(huán)境的改變及其對(duì)睪丸組織細(xì)胞的影響，將是本課題組今后的研究重點(diǎn)。