解毒軟肝合劑質(zhì)量控制方法研究

劉麗琴 周曉霞 汪 濤 陳紅斌 王 瑩

解毒軟肝合劑來源于浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院解毒軟肝協(xié)定方，有十余年臨床使用經(jīng)驗(yàn)，治療急慢性肝炎效果顯著。解毒軟肝合劑由白花蛇舌草、黨參、垂盆草、米仁、板藍(lán)根、焦山楂、葉下珠、烏賊骨、木瓜、五味子、土茯苓、炙甘草、赤芍等藥材組成。其中白花蛇舌草、葉下珠、土茯苓、板藍(lán)根清熱解毒；垂盆草清熱利濕；五味子益氣養(yǎng)陰；赤芍清熱涼血、活血祛瘀；黨參、米仁、焦山楂、木瓜和烏賊骨健脾和胃；炙甘草調(diào)和諸藥，全方共奏清熱利濕、健脾和胃之效。該復(fù)方未建立完善的質(zhì)量檢測(cè)體系以評(píng)價(jià)內(nèi)在質(zhì)量。依據(jù)《浙江省醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案管理實(shí)施細(xì)則》[1]（以下簡(jiǎn)稱《細(xì)則》）的要求，本研究使用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）對(duì)炙甘草、葉下珠、赤芍進(jìn)行定性鑒別，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)赤芍中芍藥苷進(jìn)行定量檢測(cè)，確保臨床用藥安全有效。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀（DAD 二極管陣列檢測(cè)器）；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL204 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2試藥 芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201741）、沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201605）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)111610-201607）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)120904-201620）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，芍藥苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)23180-57-6，98%），購(gòu)于成都普瑞法科技有限公司。白花蛇舌草、黨參、垂盆草、米仁、板藍(lán)根、焦山楂、葉下珠、烏賊骨、木瓜、五味子、土茯苓、炙甘草、赤芍等中藥飲片購(gòu)于浙江惠松制藥有限公司。解毒軟肝合劑（浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)分別為181029、181030、181031）；乙酸乙酯、甲苯、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇、甲酸、三氯化鐵、乙酸、正丁醇、香草醛、硫酸、磷酸均為分析純；甲醇為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC 鑒別

2.1.1炙甘草 取解毒軟肝合劑20mL 蒸干，剩余殘?jiān)糠旨尤爰状?0mL，加熱回流提取1h，之后過濾并蒸干濾液，取純化水40mL 溶解殘?jiān)?，加入正丁?0mL 進(jìn)行萃取并重復(fù)3 次，合并3 次正丁醇溶液，加入少量純化水洗滌3 次，分離正丁醇部分，之后蒸干，剩余殘?jiān)眉状?mL 溶解，為供試品溶液備用[2-3]。取適量甘草苷對(duì)照品，以甲醇為溶劑，配得2mg/mL 溶液作為對(duì)照。取甘草飲片1g，同法得藥材對(duì)照溶液。取解毒軟肝合劑中其余飲片（除炙甘草外），根據(jù)原始處方工藝，水煎得陰性成品，并按上述方法得對(duì)照溶液，作為陰性樣品。依據(jù)薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015 版四部（通則0502）[2]，使用毛細(xì)管取上述四種樣品溶液1～2μL，點(diǎn)于一塊硅膠板上，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）溶液，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色，于日光及紫外光燈（365nm）下檢視。TLC 結(jié)果顯示，對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜出現(xiàn)相似斑點(diǎn)，而陰性樣品則未出現(xiàn)干擾，見圖1。

圖1 炙甘草薄層色譜圖

2.1.2葉下珠 取解毒軟肝合劑20mL 蒸干，在殘?jiān)糠旨尤胍掖?0mL，振蕩5min 后過濾，蒸干乙醇，使用1mL 乙醇溶解殘?jiān)?，作為供試品備用。取適量沒食子酸對(duì)照品，以甲醇為溶劑，得1mg/mL 溶液為對(duì)照[4]。取解毒軟肝合劑中其余飲片（不含葉下珠），根據(jù)原始處方及工藝，水煎得陰性成品，并按上述方法得對(duì)照溶液，作為陰性樣品。根據(jù)薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015 年版四部（通則0502），使用毛細(xì)管吸取對(duì)照品、供試品溶液各5μL 點(diǎn)于同一硅膠板上，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶10∶1），顯色劑為1%三氯化鐵乙醇溶液，于日光下檢視[4]。TLC 結(jié)果顯示，在同一位置上，供試品與對(duì)照品顯示近似斑點(diǎn)，且陰性樣品未產(chǎn)生干擾，見圖2。

圖2 葉下珠薄層色譜圖

2.1.3赤芍 取解毒軟肝合劑20mL 蒸干，于殘?jiān)幖尤胍掖?0mL，振蕩5min，過濾蒸干，加入乙醇1mL 溶解殘?jiān)?，作供試品備用。取適量芍藥苷對(duì)照品，以乙醇為溶劑，得1mg/mL 溶液為對(duì)照。取解毒軟肝合劑中其余飲片（不含赤芍），根據(jù)原始處方工藝，水煎得陰性成品，并按上述方法得對(duì)照溶液，作為陰性樣品。根據(jù)薄層色譜法《中國(guó)藥典》2015 年版四部（通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品、供試品各2μL 于同一硅膠板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）為展開劑，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下觀察[5-6]。TLC 結(jié)果顯示，供試品與對(duì)照品于對(duì)應(yīng)位置呈現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)，陰性樣品則無干擾，見圖3。

圖3 赤芍薄層色譜圖

2.2HPLC 含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；流動(dòng)相流速：1.0mL/min；梯度洗脫程序：0～30min 14% A；30～60min 14%～90%A；60～61min 90%～14% A；61～70min 14% A；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃。

2.2.2芍藥苷對(duì)照品溶液配制 精密稱取適量芍藥苷對(duì)照品，以甲醇為溶劑，配成0.05707mg/mL 芍藥苷對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品制備 精密量取解毒軟肝合劑1mL 于50mL 容量瓶，加入適量乙醇，超聲處理（250W，40kHz）30min，放冷后定容至刻度，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜得供試品溶液。

2.2.4專屬性試驗(yàn) 參考解毒軟肝合劑處方及工藝，制得陰性樣品（不含麩炒枳殼），按“2.2.3”法配制陰性溶液備用。精密吸取芍藥苷對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照各10μL，使用HPLC 分析。結(jié)果顯示，陰性樣品無干擾，見圖4。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.5線性關(guān)系考察 精密吸取適量“2.2.2”中芍藥苷對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，配成5 份對(duì)照溶液，濃度依次為：0.1177、0.2354、0.3531、0.4708、0.5885mg/mL，精密吸取上述濃度系列對(duì)照溶液10μL，使用“2.2.1”條件進(jìn)行HPLC 分析。對(duì)峰面積（Y）和濃度（X，mg/mL）關(guān)系進(jìn)行擬合，得線性方程：Y=1209.474X+10.589，R2=1.000，在0.1177～0.5885μg 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.2.6儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”中芍藥苷對(duì)照溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，得芍藥苷峰面積RSD 為0.66%，表明本研究所用高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.7重復(fù)性考察 取解毒軟肝合劑（批號(hào)181029），按“2.2.3”法平行制備6 份待測(cè)溶液，使用HPLC 分析，得芍藥苷峰面積RSD 為1.63%，表明本研究建立的含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性考察 取解毒軟肝合劑（批號(hào)181029），按“2.2.3”法配制供試溶液，分別于0、2、4、8、12、24h取樣檢測(cè)，得芍藥苷峰面積RSD 為0.53%，表明解毒軟肝合劑在24h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率考察 精密量取0.5mL 解毒軟肝合劑（已知含量）6 份，加入定量芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)“2.2.3”法配制待測(cè)溶液，使用HPLC 分析。計(jì)算得樣品回收率平均值為99.06%，RSD=1.36%，計(jì)算公式如下，結(jié)果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收率（n=6）

2.2.10樣品含量測(cè)定 取3 批解毒軟肝合劑各3份，以“2.2.3”法制備待測(cè)溶液，采用HPLC 分析，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1TLC 鑒別藥味的選擇 本研究采用TLC 對(duì)解毒軟肝合劑中的炙甘草、葉下珠、赤芍、板藍(lán)根及黨參5 個(gè)藥味進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黨參樣品存在顯著的陰性干擾，板藍(lán)根樣品的斑點(diǎn)不清晰，而炙甘草、葉下珠、赤芍的鑒別效果好，專屬性強(qiáng)，分離度高，且陰性樣品不存在干擾，因此選擇TLC 定性鑒別炙甘草、葉下珠、赤芍，作為解毒軟肝合劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2TLC 鑒別濕度條件考察 濕度易影響TLC 結(jié)果，本研究比較不同濕度條件下炙甘草、葉下珠、赤芍的薄層展開效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濕度條件下，樣品斑點(diǎn)均能達(dá)到較好分離，方法的耐用性較好。

3.3HPLC 定量指標(biāo)的選擇[7]前期研究發(fā)現(xiàn)，君藥白花蛇舌草和葉下珠在《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015版中均沒有含量測(cè)定項(xiàng)。而預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，赤芍中的芍藥苷含量較高，故本品以芍藥苷為指標(biāo)成分，使用HPLC 法測(cè)定含量。結(jié)果表明，本研究建立的液相方法定量準(zhǔn)確，誤差小，可用于解毒軟肝合劑中芍藥苷含量的測(cè)定。

3.4洗脫系統(tǒng)的選擇[8-12]解毒軟肝合劑組分多，化學(xué)成分復(fù)雜，因此需要復(fù)雜的流動(dòng)相體系以分離待測(cè)組分。本實(shí)驗(yàn)考察不同流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-0.5%冰醋酸溶液以及乙腈-0.1%磷酸溶液），結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫分離效果最佳。液相圖譜上各個(gè)色譜峰分離度較好，基線較平穩(wěn)，保留時(shí)間適中。經(jīng)方法學(xué)考察，線性、重復(fù)性、回收率等均符合要求。

綜上所述，本研究針對(duì)解毒軟肝合劑建立TLC鑒別及HPLC 含量測(cè)定相結(jié)合的質(zhì)量控制體系，該體系操作簡(jiǎn)便，快捷準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性，能夠較為全面地測(cè)定解毒軟肝合劑的有效成分，控制合劑整體質(zhì)量，進(jìn)而保證臨床應(yīng)用的安全有效。