GSK-3β參與氯化鋰修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的可能機(jī)制

李志民，曹 興，余巨明，蔣國(guó)會(huì)

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川南充 637000)

癲癇是一種腦部神經(jīng)元異常放電且反復(fù)發(fā)作為特征的常見腦部疾病[1]，目前還沒有太多辦法能夠抑制癲癇的發(fā)生。顱內(nèi)感染作為癲癇的重要病因[2]，抑制顱內(nèi)感染炎性環(huán)境從而抑制癲癇的發(fā)生無(wú)疑是研究的方向。雖然抗感染治療能降低腦炎病死率，但不能改變腦炎后形成癲癇的結(jié)果。目前亦推薦預(yù)防性抗癲癇治療[3-5]。盡管顱內(nèi)感染是如何導(dǎo)致癲癇發(fā)作和癲癇形成的具體機(jī)制迄今還不十分清楚，但推測(cè)可能與促炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(IL)-1β、 腫瘤壞死因子(TNF)-α]、抗炎細(xì)胞因子(IL-10)失衡，膠質(zhì)細(xì)胞異常激活及神經(jīng)元的變性壞死共同導(dǎo)致腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)引起異常興奮有關(guān)[6-7]。

糖原合成激酶-3β (GSK-3β)是炎癥TLR4信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，抑制GSK-3β可以達(dá)到明顯抗炎作用，而激活GSK-3β則具有明顯促炎作用[8]，因而對(duì)維持機(jī)體炎癥平衡起到至關(guān)重要的作用。它作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能并不單一。GSK-3β通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶去磷酸化激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，然而通過促進(jìn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化(P -GSK-3β)而達(dá)到細(xì)胞保護(hù)的作用，均通過pI3K/Akt通路影響GSK-3β的活性[9]。Wortmannin(WT)抑制pI3K使絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶去磷酸化而激活[10]，因此被視為GSK-3β的激動(dòng)劑。氯化鋰(LiCl)和丙戊酸(VPA)能使GSK-3β磷酸化失活，故被視為GSK-3β的抑制劑。LiCl在精神疾病中發(fā)揮了重要作用，目前研究其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦和脊髓損傷[11]及神經(jīng)變性疾病如帕金森病[12]的治療也發(fā)揮一定作用。然而，LiCl對(duì)大鼠顱內(nèi)感染及顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的影響還鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LiCl對(duì)癲癇發(fā)作的影響可能與劑量相關(guān)，小劑量LiCl(小于40 mg/kg)可能抑制癲癇發(fā)作，而大劑量LiCl(大于60 mg/kg)可促進(jìn)癲癇的發(fā)作[13]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)得出LiCl對(duì)大鼠顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的影響具有劑量依賴效應(yīng)，但具體機(jī)制尚不清楚。因此本研究采用不同水平的LiCl、VPA及WT干預(yù)顱內(nèi)感染模型大鼠，通過免疫組織化學(xué)、Western blot、ELISA、電生理檢測(cè)的方法，探討GSK-3β在LiCl影響顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的關(guān)系，進(jìn)而為顱內(nèi)感染后癲癇的預(yù)防提供方向。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取8～10周齡約200 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(均由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；LiCl、LPS(美國(guó)Sigma 公司)、小膠質(zhì)細(xì)胞抗體 (IBA-1，日本W(wǎng)ako 公司)、毛果蕓香堿(Pilo，美國(guó)Sigma公司)、Wortmannin (美國(guó)Abmole公司)、抗-Phospho-GSK-3α/β抗體、抗-GSK-3α/β抗體(美國(guó)R&D公司)、IL-10、IL-1β、TNF-α檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司)、神經(jīng)元特異性核蛋白抗體(NeuN，美國(guó)Millipore公司)、β-actin多克隆抗體(北京中杉金橋公司)。川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)該實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組

制備脂多糖(LPS)顱內(nèi)感染大鼠模型[14]：在大鼠側(cè)腦室 (前囟后0.8 mm，旁開1.3 mm，入腦 3.5 mm) 采用注射LPS 50 μg，建立大鼠顱內(nèi)感染模型。對(duì)照組(5只)給予側(cè)腦室注射同體積生理鹽水5 mL/kg。觀察記錄實(shí)驗(yàn)鼠行為活動(dòng)，并于24 h檢測(cè)實(shí)驗(yàn)鼠海馬組織中炎癥因子和GSK-3β的水平。

側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)顱內(nèi)感染大鼠105只，然后將其均分為L(zhǎng)PS組,LPS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組，以及LPS-VPA組和LPS-WT組。對(duì)應(yīng)分組分別進(jìn)行腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，LiCl 10、20、40、80 mg/kg，以及VPA 30 mg/kg和WT 0.6μg/kg[15]，LiCl<40 mg/kg時(shí)為L(zhǎng)PS-小劑量LiCl組。每24小時(shí)1次，連續(xù)3 d。

1.2.2癲癇大鼠模型造模及其電生理檢測(cè)[16]

根據(jù)3.3 mL/kg的比例，采用水平為10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，然后將其置于腦立體定位注射儀上。乙醇消毒后對(duì)大鼠進(jìn)行備皮，沿顱骨中縫剪開頭皮后以Bregma十字縫為參照向左移2.6 mm，向后移3.6 mm為中點(diǎn)用顱骨鉆開一邊長(zhǎng)為3 mm骨窗。在骨窗近鼻端鉆2小孔并插入固定小螺栓用于連接參考電極。參照大鼠腦圖譜，以Bregma十字縫為參照向后3.6 mm,向左2.6 mm移動(dòng) 4×4微陣列排列的16導(dǎo)微絲電極至左側(cè)海馬CA1區(qū)并用微推進(jìn)器向下刺入腦中3.5 mm，然后連接相應(yīng)電極。待大鼠麻醉蘇醒后，使用16導(dǎo)在體電生理記錄儀(美國(guó)Plexon公司)和OmniPlex?D神經(jīng)信號(hào)采集系統(tǒng)(美國(guó)Plexon公司)記錄大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的電活動(dòng)信號(hào)。首先，采集15 min大鼠清醒狀態(tài)下的腦電信號(hào)作為基準(zhǔn)線；然后按照360 mL/kg的劑量腹腔注射毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)并記錄30 min。采用腦電分析系統(tǒng)(NeuroExplorer?v4.0)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腦電信號(hào)進(jìn)行ripples振蕩和SE海馬局部場(chǎng)電位的FRs的功率譜密度均值。

1.2.3IL-1β、TNF-α和IL-10水平檢測(cè)

用水合氯醛(3.3 mL/kg，腹腔注射)麻醉大鼠后斷頭取腦，快速分離雙側(cè)海馬組織(冰上操作)迅速放入勻漿管制作勻漿，而后將勻漿液移入離心管，于4 ℃、 12 000 r/min離心15 min。取上清液，用Bradford 法測(cè)定蛋白水平后分裝于0.5 mL離心管。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、TNF-α和IL-10檢測(cè)。

1.2.4p-GSK-3β和GSK-3β水平檢測(cè)[16]

采用Western blot對(duì)p-GSK-3β和GSK-3β兩個(gè)靶蛋白進(jìn)行定量分析。將實(shí)驗(yàn)大鼠海馬區(qū)提取的蛋白質(zhì)裂解液用10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。然后，采用半干式轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上。檢測(cè)條件：5%脫脂牛奶，室溫封閉硝酸纖維素薄膜2 h；然后，將封閉液更換為一抗溶液，分別為1∶1 000稀釋的兔抗鼠的p-GSK-3β多克隆抗體溶液、GSK-3β多克隆抗體溶液和β-actin多克隆抗體溶液，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，回收一抗溶液，并用PBS洗滌硝酸纖維素薄膜3次，每次5 min。然后，室溫用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育1.5 h。PBS洗滌硝酸纖維素薄膜3次后，用新鮮配制的化學(xué)發(fā)光顯色劑對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行顯影。用Image J軟件測(cè)定各蛋白質(zhì)條帶的灰度值，以靶蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值之比表示靶蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)

采用水平為10%的水合氯醛，按照3.3 mL/kg的劑量，對(duì)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉。將小鼠固定后用生理鹽水灌流大鼠洗滌血細(xì)胞。待右心耳流出液呈無(wú)色后再用4%多聚甲醛灌流大鼠。大鼠灌流完成后小心取出腦組織并置于4%多聚甲醛溶液中后固定24 h。將后固定好的腦組織經(jīng)脫水處理后，用石蠟包埋并制作連續(xù)的冠狀組織切片(每片4 μm厚)。海馬區(qū)腦組織切片每間隔4張取1張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。使用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體IBA-1(1∶200)檢測(cè)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞；用神經(jīng)元特異性抗體NeuN(1∶1 000)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞。所有組織切片均用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。

參照YANG等[17]的方法，對(duì)免疫組織化學(xué)染色的腦組織切片進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。在40倍放大的顯微鏡視野下，選取海馬CA1及鄰近皮質(zhì)區(qū)中具有代表性的，非重疊區(qū)域(400 μm×400 μm)進(jìn)行NeuN+和IBA-1+細(xì)胞計(jì)數(shù)。所有的細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域均由觀察者預(yù)先設(shè)定，并采用Image-Pro Plus Media Cybernetics系統(tǒng)對(duì)NeuN+和IBA-1+細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)視野中，只有形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞清晰可辨的NeuN+和IBA-1+細(xì)胞才會(huì)被計(jì)數(shù)。由于大鼠左、右大腦半球的細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差別，故不特意區(qū)分左、右半球，并將Image-Pro Plus Media Cybernetics系統(tǒng)獲得的結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 顱內(nèi)感染大鼠模型中海馬GSK-3β和p-GSK-3β的變化

2.1.1LPS顱內(nèi)感染大鼠模型

相比對(duì)照組大鼠而言，LPS組活動(dòng)明顯減少、食物攝入量降低、飲水量增加、體溫上升明顯。在LPS組的海馬組織中存在明顯的促炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.1.2大鼠海馬組織中GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá)

Western blot分析表明LPS組的大鼠海馬組織中GSK-3β水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，而p-GSK-3β水平卻明顯比對(duì)照組降低，見圖2。

2.2 不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染模型大鼠各種檢測(cè)指標(biāo)的影響

2.2.1炎性因子在不同干預(yù)處理組中的表達(dá)

與LPS組相比LPS-小劑量LiCl組及LPS-VPA組的海馬組織中IL-10的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬組織中IL-10的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖3A。LPS-小劑量LiCl組、LPS-VPA組的海馬組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，LPS-80 mg/kg LiCl組及LPS-WT組的海馬組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖3B、C。

A：Western blot檢測(cè)；B：GSK-3β相對(duì)表達(dá)水平；C：p-GSK-3β相對(duì)表達(dá)水平；a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

A：IL-10；B：TNF-α；C：IL-1β；1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS-VPA組；7：LPS-WT組；a:P<0.05，與LPS組比較。

2.2.2不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染大鼠模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響

LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)比LPS組的更為完整，排列也更整齊而致密、細(xì)胞核脫失少、染色較深。小劑量LiCl干預(yù)組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組及LPS-WT組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的損壞比LPS組更為嚴(yán)重，神經(jīng)元排列松散、散亂，細(xì)胞核脫失嚴(yán)重、著色較淺。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與LPS-80 mg/kg LiCl組、LPS-WT組和LPS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

2.2.3不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染大鼠模型海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活比LPS明顯要少(P<0.05)；而LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活比LPS組顯著增多(P<0.05)，見圖6、7。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；5：LPS-VPA組；6：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

A：LPS組；B～E:分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；F：LPS-WT組；G：LPS-VPA組。

A：LPS組；B～E:分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；F：LPS-WT組；G：LPS-VPA組。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS-VPA組；7：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

2.2.4不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染模型大鼠癲癇發(fā)作的影響

比較各干預(yù)組和LPS組的基礎(chǔ)腦電信號(hào)、癇性首次發(fā)作和SE潛伏期、SE期的局部場(chǎng)電位變化。(1)不同干預(yù)對(duì)海馬局部場(chǎng)電位ripples振蕩功率的影響：LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬CA1區(qū)的ripples振蕩功率與LPS組相比，明顯降低(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的海馬CA1區(qū)的ripples振蕩功率與LPS組相比，顯著升高(P<0.05)，見圖8。(2)不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染模型大鼠SE潛伏期的影響：LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的SE潛伏期與LPS組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的SE潛伏期與LPS組相比明顯縮短(P<0.05)。LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的癲癇發(fā)作頻譜能量與LPS組相比明顯降低(P<0.05)，LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組的癲癇發(fā)作頻譜能量與LPS對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，見圖9、10。(3)不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染模型大鼠SE期FRs的功率譜密度均值的影響：LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組的海馬區(qū)SE期FRs的功率譜密度均值與LPS組相比明顯降低(P<0.05)，LPS-80 mg/kg LiCl干預(yù)組和LPS-WT組的海馬區(qū)SE期FRs的功率譜密度均值與LPS組相比明顯升高(P<0.05)，見圖11、12。

2.2.5不同干預(yù)對(duì)顱內(nèi)感染模型大鼠海馬組織中GSK-3β和p-GSK-3β的影響

Western blot分析顯示，LPS-小劑量LiCl組和LPS-VPA組海馬組織中GSK-3β/p-GSK-3β的比值與LPS組相比明顯變小(P<0.05)。LPS-80 mg/kg LiCl組和LPS-WT組海馬組織中GSK-3β/p-GSK-3β的比值與LPS組相比明顯增大(P<0.05)，見圖13。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS- VPA組；7：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

A：LPS組；B～E:分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；F：LPS-WT組；G：LPS-VPA組。深紅色箭頭指示了腹腔注射毛果蕓香堿的起始時(shí)間，黑色箭頭指示了模型大鼠進(jìn)入SE的起始時(shí)間。癲癇發(fā)作頻譜圖的橫坐標(biāo)代表時(shí)間(s)，縱坐標(biāo)代表癲癇發(fā)作頻率(Hz)，左側(cè)彩色條帶為頻譜能量示例，頻譜能量較高的以紅色表示，頻譜能量較低的則以藍(lán)色表示。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS-VPA組；7：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS- VPA組；7：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

A:LPS組；B～E:分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl干預(yù)組；F:LPS-WT組；G：LPS-VPA組。

1：LPS組；2～5：分別為L(zhǎng)PS-10、20、40、80 mg/kg LiCl組；6：LPS-VPA組；7：LPS-WT組；a：P<0.05，與LPS組比較。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的LiCl干預(yù)顱內(nèi)感染大鼠，電生理研究結(jié)果海馬局部場(chǎng)電位(LFPs)顯示小劑量LiCl干預(yù)后延長(zhǎng)了毛果蕓香堿誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，降低了SE期的快速高頻振蕩(FRs)功率譜密度均值，大劑量LiCl干預(yù)后則結(jié)果相反，由此得出小劑量LiCl降低了顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的易感性及減輕癲癇發(fā)作程度，LiCl對(duì)大鼠顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作差異性影響的機(jī)制目前尚不十分清楚。盡管有證據(jù)表明感染所致的血腦屏障通透性增加、膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖、炎性介質(zhì)大量釋放、神經(jīng)元興奮性改變及變性壞死等一系列病理生理改變，均可能參與了顱內(nèi)感染后癇性發(fā)作和癲癇形成的過程[11-13]。本實(shí)驗(yàn)也得出小劑量LiCl干預(yù)后減少了顱內(nèi)感染大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低了海馬促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平，增加了抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，減輕了海馬神經(jīng)元的變性壞死。而大劑量LiCl干預(yù)后則結(jié)果相反。

本研究首先確定大鼠側(cè)腦室注射LPS 24 h后，大鼠活動(dòng)明顯減少、食物攝入量降低、飲水量增加、體溫上升明顯，且海馬促炎細(xì)胞因子顯著增高，表明成功誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)感染，并發(fā)現(xiàn)大鼠感染后腦內(nèi)海馬GSK-3β水平有升高及p-GSK-3β水平降低變化，因此推測(cè)大鼠顱內(nèi)炎癥嚴(yán)重程度可能與GSK-3β的活性有關(guān)。在LPS致大鼠顱內(nèi)感染的基礎(chǔ)上，采用GSK-3β間接抑制劑VPA(30 mg/kg)和GSK-3β激動(dòng)劑WT(0.6 μg/kg)分別干預(yù)顱內(nèi)感染模型大鼠后，Western blot結(jié)果顯示VPA與小劑量LiCl干預(yù)后均使顱內(nèi)感染大鼠海馬中p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯變大(P<0.05)，WT、與大劑量LiCl干預(yù)后均使顱內(nèi)感染大鼠海馬p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯變小(P<0.05)，p-GSK-3β與GSK-3β 的比值大小體現(xiàn)GSK-3β活性的高低。因此VPA與小劑量LiCl干預(yù)后抑制了顱內(nèi)感染模型大鼠海馬GSK-3β活性，WT、與大劑量LiCl干預(yù)后則增加了顱內(nèi)感染模型大鼠海馬GSK-3β活性。研究證實(shí)抑制GSK-3β可有效減輕外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥[18]，而激活GSK-3β可間接誘導(dǎo)IL-6、TNF-α的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)CD11b表達(dá)而加重炎癥[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果小劑量LiCl與VPA減少了海馬CA1小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，同時(shí)海馬促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α分泌減少，抗炎細(xì)胞因子IL-10分泌增加，而大劑量LiCl與WT干預(yù)后則得出相反的結(jié)果，YU等[20]發(fā)現(xiàn)LiCl通過促進(jìn)GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制神經(jīng)炎癥作用。本實(shí)驗(yàn)表明LiCl對(duì)顱內(nèi)炎癥影響的差異可能是通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

LiCl和VPA作為膜穩(wěn)定劑，對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用，LiCl通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來(lái)直接影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作，還是通過調(diào)節(jié)GSK-3β的活性來(lái)調(diào)控顱內(nèi)炎癥從而間接影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作，目前尚不清楚。但LiCl在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，LiCl主要通過抑制GSK-3β的活性來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)。眾多研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)GSK-3β途徑亦發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21-22]。本實(shí)驗(yàn)和其他研究均發(fā)現(xiàn)LPS誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠的海馬總GSK-3β水平增加[23]。LPS誘發(fā)顱內(nèi)感染大鼠癲癇發(fā)作的敏感性顯著增加。推測(cè)GSK-3β可能與癲癇發(fā)作的敏感性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小劑量LiCl與VPA干預(yù)后明顯延長(zhǎng)了顱內(nèi)感染后SE潛伏期，而大劑量LiCl與WT干預(yù)后明顯縮短了顱內(nèi)感染后SE潛伏期，這種結(jié)果可能與LiCl參與調(diào)節(jié)GSK-3β的活性有關(guān)。研究表明毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后海馬的GSK-3β的水平增加，因此GSK-3β與癲癇的發(fā)作可能直接相關(guān)[24]。 本研究利用的GSK-3β抑制劑VPA干預(yù)，結(jié)果與小劑量LiCl干預(yù)相同，均降低了癇性發(fā)作的敏感性。而利用GSK-3β的激動(dòng)劑，結(jié)果與小劑量LiCl干預(yù)結(jié)果相反，與大劑量LiCl干預(yù)結(jié)果相同，增加了癇性發(fā)作的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS誘發(fā)的顱內(nèi)感染大鼠海馬的GSK-3β水平增高，p-GSK-3β的水平降低。GREEN等[23]用LPS刺激體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞GSK-3β水平較未刺激組明顯增加，而p-GSK-3β水平較未刺激組明顯減少，因而證明了炎癥提高了GSK-3β的表達(dá)活性，同樣用LiCl和LPS同時(shí)干預(yù)發(fā)現(xiàn)LPS-LiCl組較LPS組GSK-3β的表達(dá)活性明顯降低，而p-GSK-3β的表達(dá)活性相反，表明GSK-3β與炎癥直接相關(guān)。然而在紅藻氨酸誘導(dǎo)癲癇模型的研究中敲出多巴胺D2受體(D2R)基因的小鼠，意外發(fā)現(xiàn)其海馬中 GSK-3β顯著活化，增加了紅藻氨酸對(duì)小鼠的興奮毒性，促進(jìn)了海馬神經(jīng)元的凋亡，增加了小鼠對(duì)紅藻氨酸誘發(fā)癲癇的敏感性；然而使GSK-3β磷酸化后，明顯減輕了紅藻氨酸對(duì)海馬神經(jīng)元興奮毒性，減少了海馬細(xì)胞的凋亡和壞死[25]。提示GSK-3β通過影響海馬神經(jīng)元興奮毒性及變性壞死導(dǎo)致癲癇發(fā)作。然而本研究發(fā)現(xiàn)小劑量LiCl和VPA干預(yù)后海馬局部場(chǎng)電位功率譜密度值ripples振蕩功率譜較LPS組明顯降低，且海馬神經(jīng)元凋亡和壞死較少，而大劑量LiCl和WT干預(yù)則出現(xiàn)相反的結(jié)果。海馬局部場(chǎng)電位ripples振蕩功率譜可能與癲癇發(fā)作相關(guān)[26]，其功率譜密度值的高低則代表作海馬神經(jīng)元的興奮性。因此小劑量LiCl降低了顱內(nèi)感染大鼠海馬神經(jīng)元興奮性，而大劑量LiCl和WT則作用相反。似乎也驗(yàn)證了通過調(diào)節(jié)GSK-3β活性而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性。雖然有報(bào)道紅藻氨酸誘發(fā)癲癇24 h后海馬中的GSK-3β的活化明顯[27]。但也有報(bào)道稱顳葉癲癇患者海馬組織中的p-GSK-3β明顯高于沒有癲癇的患者，但GSK-3β水平輕微增高[28]。GSK-3β僅是WNT信號(hào)通路的一部分，有研究發(fā)現(xiàn)癲癇后GSK-3β的活化改變可獨(dú)立于WNT途徑[25]；也有學(xué)者認(rèn)為GSK-3β是通過多因素多途徑共同作用于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸釋放影響癲癇發(fā)作[28]。近年研究發(fā)現(xiàn)洛伐他汀通過抑制GSK-3β的活性，成功的減少了癲癇大鼠海馬齒狀回(DG)苔蘚纖維發(fā)芽(MFS)[24]，DG中的MFS是反復(fù)自發(fā)性發(fā)作的發(fā)作頻率和顳葉癲癇的嚴(yán)重性高度相關(guān)的重要指標(biāo)[29-31]。因此抑制GSK-3β的活性可以減輕癲癇的發(fā)作程度和腦損傷。已有研究報(bào)道FRs可作為癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度的標(biāo)志[32-34]，且與神經(jīng)元變性丟失相關(guān)[35]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS-小劑量LiCl組及LPS-VPA組SE期FRs的功率譜密度均值較LPS組比較明顯降低(P<0.05)，因此可以得出小劑量LiCl及VPA減輕了顱內(nèi)感染模型大鼠的癲癇發(fā)作程度和神經(jīng)元的變性丟失。因此GSK-3β并非直接影響LiCl對(duì)顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作。而是小劑量LiCl抑制顱內(nèi)感染大鼠海馬組織中GSK-3β的表達(dá)，抑制炎癥因子，減輕組織病理?yè)p傷，延長(zhǎng)腦炎后癲癇放電潛伏期，降低海馬神經(jīng)元興奮性，提高癲癇發(fā)作閾值，降低腦炎后癲癇發(fā)作的敏感性，減輕癲癇發(fā)作程度；大劑量LiCl則結(jié)果相反。提示GSK-3β可能參與LiCl修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的機(jī)制。

綜上所述，LiCl可能通過影響GSK-3β活性，從而影響膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步影響神經(jīng)元的變性，最后影響神經(jīng)元的異常放電，達(dá)到影響顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作。因此調(diào)控GSK-3β的活性可望成為改善顱內(nèi)感染后癲癇的發(fā)作治療靶點(diǎn)。