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    幼年早期和成年大熊貓胰腺組織miRNA初步研究

    2022-03-23 12:24:24楊苗孫潔沈富軍凌珊珊吳虹林張亮侯蓉黃炎岳碧松張修月
    四川動(dòng)物 2022年2期
    關(guān)鍵詞:大熊貓胰腺調(diào)控

    楊苗,孫潔,沈富軍,凌珊珊,吳虹林,張亮,侯蓉,黃炎,岳碧松,張修月*

    (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610065;2.成都大熊貓繁育研究基地,四川省瀕危動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610081;3.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心,大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川都江堰623006)

    大熊貓屬于食肉目Carnivora,是我國(guó)珍稀瀕危野生動(dòng)物,幼年早期主要以母乳為食,成年卻專性以竹子為食。大熊貓母乳營(yíng)養(yǎng)豐富,含有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪(Nakamura.,2003),而竹子屬于低營(yíng)養(yǎng)高纖維食物。不僅如此,大熊貓消化道短且無(wú)盲腸,食物通過(guò)時(shí)間短,依然保留著肉食性消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和遺傳系統(tǒng)特征(鄒興淮等,1998)。因此,大熊貓生長(zhǎng)過(guò)程中,營(yíng)養(yǎng)利用與食物代謝及其變化可能與一般的草食動(dòng)物和肉食動(dòng)物均不同,具有其獨(dú)特性。研究大熊貓生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)利用及調(diào)控特征對(duì)其保護(hù)具有重要意義。

    胰腺是動(dòng)物重要的消化代謝器官,作為第二大消化腺,兼具內(nèi)分泌和外分泌的雙重功能。胰腺分泌胰液經(jīng)胰導(dǎo)管輸送至十二指腸的過(guò)程即為外分泌,胰液中含有的堿性碳酸氫鹽及各種消化酶可中和胃酸,消化糖類、蛋白質(zhì)及脂肪。胰腺的內(nèi)分泌主要依靠?jī)?nèi)部的胰島細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、胰高血糖素及生長(zhǎng)激素釋放抑制激素和胃泌素等(Leung,2010;Lorberbaum.,2020)。

    轉(zhuǎn)錄組水平研究表明,大熊貓?jiān)谟啄暝缙诘哪懝檀即x、蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因高表達(dá),以滿足其對(duì)營(yíng)養(yǎng)的高需求,有利于出生后的快速生長(zhǎng)。碳水化合物代謝、能量產(chǎn)生、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),表明成年大熊貓具有高的代謝水平(Ma.,2020)。但其具體代謝調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。microRNA(miRNA)作為一種非編碼的短序列RNA,已被證實(shí)能夠參與多種形式的生命活動(dòng),如疾病、免疫、細(xì)胞凋亡、代謝、生殖和發(fā)育等(Ambros,2004;Wienholds & Plasterk,2005)。胰腺組織相關(guān)miRNA的研究表明,一些miRNA可能參與胰腺的發(fā)生,包括miR-124(Baroukh.,2007),miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195(Joglekar.,2007),miR-376、miR-375(Kloosterman.,2007;Joglekar.,2009)和miR-7(Correa-Medina.,2009;Joglekar.,2009)等,這些miRNA的異常表達(dá)會(huì)影響胰腺的正常發(fā)育和生理功能(Dumortier & Obberghen,2012)。此外,miRNA可以調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程,包括脂類代謝(Esau.,2006)、氨基酸代謝(Dang,2009;Sengupta.,2020)、糖代謝(Eichner.,2010;Kefas.,2010)等。因此,通過(guò)對(duì)大熊貓不同年齡階段胰腺組織中差異miRNA的分析,可以了解在大熊貓從幼年到成年的食性轉(zhuǎn)變過(guò)程中,miRNA對(duì)營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控作用。

    本研究探討幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達(dá)譜的差異,以了解miRNA對(duì)幼年早期和成年大熊貓營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控差異。

    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    1.1 樣本采集

    大熊貓胰腺組織樣本由成都大熊貓繁育研究基地和中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心提供。從4只死亡個(gè)體中采集到了4份胰腺樣本,其中,樣本YR和LT為1日齡和6日齡,死亡原因?yàn)橐馔庵舷ⅲ粯颖綝N和CC為成年個(gè)體,為野外嚴(yán)重受傷,搶救無(wú)效死亡。所有樣本的胰腺組織均未見病理改變。采樣工作由專業(yè)獸醫(yī)進(jìn)行,項(xiàng)目研究經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):20190506001)。

    1.2 Small RNA提取和測(cè)序

    對(duì)胰腺組織勻漿后,使用Trizol試劑按照說(shuō)明提取RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)樣本的完整性和質(zhì)量,RNA完整值(RIN)≥7.5,說(shuō)明樣本具有較好完整性,可用于后續(xù)small RNA建庫(kù)測(cè)序。使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫(kù),將提取的總RNA過(guò)濾后得到 15~40個(gè)核苷酸的small RNA。用T4連接酶將small RNA的3’和5’端加上接頭,PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到small RNA文庫(kù)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化檢測(cè)合格后,由北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2000。

    1.3 Small RNA數(shù)據(jù)處理

    測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)需經(jīng)質(zhì)控后才可用于后續(xù)分析,因此對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理:首先,刪除質(zhì)量值≤5的reads占總讀段>50%的低質(zhì)量序列,去除N(無(wú)法確定堿基信息)比例>10%的序列。其次,刪除5’接頭污染的序列和沒有3’接頭和插入片段的序列。修剪3’接頭序列后,去除有poly A、poly T、poly C和poly G的序列。最后,去除過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的序列,保留18~30 nt的序列用于后續(xù)分析。為避免非miRNA序列對(duì)結(jié)果的影響,使用BLASTN對(duì)非miRNA進(jìn)行注釋。為確保每個(gè)small RNA僅分配 1個(gè)注釋,使用以下規(guī)則:rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat sequences。刪除非miRNA后,使用miRDeep2將剩余序列比對(duì)到大熊貓參考基因組,鑒定保守miRNA及預(yù)測(cè)新miRNA。

    1.4 保守miRNA差異表達(dá)分析

    使用miRDeep2中的quantifier.pl腳本計(jì)算每個(gè)樣本miRNA的表達(dá)量,得到原始表達(dá)矩陣,導(dǎo)入 R軟件的DEseq2程序包進(jìn)行差異表達(dá)分析。DESeq2的estimateSizeFactors函數(shù)可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以消除測(cè)序文庫(kù)的影響。使用標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)計(jì)算每個(gè)miRNA的表達(dá)量并采用Benjamini-Hochberg修正方法對(duì)值進(jìn)行調(diào)整。以|log(fold change)|≥1且<0.05作為差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNA,DE miRNA)篩選的閾值。

    1.5 預(yù)測(cè)靶基因

    使用miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因,該數(shù)據(jù)庫(kù)中的miRNA靶基因已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(Huang.,2020),可提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    1.6 miRNA與mRNA的相互作用關(guān)系

    為探究miRNA與mRNA之間的靶向調(diào)控關(guān)系,對(duì)已有mRNA樣本的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析。mRNA數(shù)據(jù)來(lái)自Ma等(2020)的研究,獲得了該論文中與本研究一致的YR、LT與DN、CC 4只個(gè)體胰腺組織的原始表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。將YR、LT與DN、CC的表達(dá)量數(shù)據(jù)同樣采用DEseq2程序包進(jìn)行差異表達(dá)分析,并認(rèn)為符合|log(fold change)|≥1且<0.05篩選條件的基因是顯著差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG)。miRNA主要通過(guò)使其靶基因沉默表達(dá)來(lái)起調(diào)控作用(Huntzinger & Izaurralde,2011),因此,本研究主要討論與其靶向基因表達(dá)有負(fù)相關(guān)的DE miRNA。

    1.7 miRNA靶基因的富集分析

    為了解miRNA的功能,分別對(duì)鑒定出的DE miRNA的靶向DEG進(jìn)行富集分析。使用g:Profiler將其映射到基因本體論(GO)(http://www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù),其中,<0.05的條目和通路被認(rèn)為是顯著富集的。

    2 結(jié)果

    2.1 Small RNA序列特征

    測(cè)序獲得4只大熊貓胰腺組織的small RNA數(shù)據(jù),質(zhì)控保留長(zhǎng)度18~30 nt的序列后,共獲得 46 357 895 條small RNA序列(圖1)。

    圖1 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中small RNA分類注釋及其所占比例統(tǒng)計(jì)

    2.2 保守miRNA的識(shí)別和新miRNA的預(yù)測(cè)

    將miRNA與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共獲得202個(gè)保守miRNA和8個(gè)新miRNA。其中,保守miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中較為豐富,在成年大熊貓胰腺組織中較少。202個(gè)保守miRNA中,有36個(gè)在幼年早期大熊貓胰腺中特有表達(dá),成年大熊貓胰腺組織未見表達(dá)(圖2)。

    圖2 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中保守miRNA數(shù)目維恩圖

    2.3 幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達(dá)

    miRNA的差異表達(dá)分析顯示,幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達(dá)存在較大差異。共獲得77個(gè)DE miRNA,其中,在成年大熊貓胰腺組織中,39個(gè)上調(diào),38個(gè)下調(diào)(圖3)。

    圖3 DE miRNA的聚類熱圖

    2.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

    通過(guò)miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè),幼年早期個(gè)體中特有的36個(gè)miRNA共預(yù)測(cè)到3 488個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因。DE miRNA中,成年大熊貓胰腺組織中39個(gè)上調(diào)的miRNA預(yù)測(cè)到 5 836個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因,38個(gè)下調(diào)的預(yù)測(cè)到4 193個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因。

    2.5 miRNA靶基因功能富集分析

    幼年早期個(gè)體中特有的36個(gè)miRNA的靶基因GO富集分析顯示,幼年早期個(gè)體特有的miRNA主要參與了物質(zhì)代謝及合成等生物過(guò)程的調(diào)控,如,細(xì)胞代謝過(guò)程的調(diào)控(GO:0031323)、生物合成過(guò)程的調(diào)控(GO:0009889)和大分子代謝過(guò)程的調(diào)控(GO:0060255)等。

    DE miRNA的靶基因富集分析顯示,上調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果多與細(xì)胞、大分子、含氮化合物等代謝的正調(diào)控有關(guān),KEGG富集結(jié)果多與信號(hào)通路和疾病通路等有關(guān)。下調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果與上調(diào)DE miRNA功能相反,主要參與細(xì)胞、大分子及含氮化合物等代謝的負(fù)調(diào)控,KEGG富集結(jié)果也多與信號(hào)通路和疾病通路相關(guān)。

    2.6 miRNA與mRNA的相互作用關(guān)系的構(gòu)建

    mRNA差異表達(dá)分析顯示,成年大熊貓胰腺組織中獲得661個(gè)上調(diào)DEG和691個(gè)下調(diào)DEG。將39個(gè)上調(diào)DE miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因與691個(gè)下調(diào)DEG取交集處理,得到240個(gè)由上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG(圖4)。將38個(gè)下調(diào)DE miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因與661個(gè)上調(diào)DEG取交集處理,得到 138個(gè)由下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG(圖5)。

    圖4 上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG

    圖5 下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG

    2.7 DE miRNA-DEG富集分析

    為探究交集基因的生物學(xué)功能,對(duì)由DE miRNA調(diào)控的DEG進(jìn)行了富集分析。KEGG富集結(jié)果顯示,成年組中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG主要富集到蛋白質(zhì)消化吸收等通路(圖6:A)。成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG主要富集到疾病、信號(hào)通路及氨基酸代謝等相關(guān)通路(圖6:B)。

    圖6 DE miRNA調(diào)控的DEG的KEGG富集結(jié)果

    2.8 消化代謝相關(guān)基因及調(diào)控基因表達(dá)的miRNA分析

    胰腺是重要的消化代謝器官,為探究miRNA對(duì)不同年齡大熊貓消化代謝的調(diào)控作用,對(duì)參與糖代謝、脂質(zhì)代謝以及蛋白質(zhì)代謝等生物過(guò)程的相關(guān)基因及其調(diào)控miRNA進(jìn)行分析。其中,編碼電子傳遞鏈主要蛋白,在成年組中顯著上調(diào),是miR-1307的靶基因之一。與膽固醇代謝有關(guān),在成年組中顯著下調(diào),是miR-1的靶基因之一。蛋白質(zhì)消化代謝相關(guān)基因中,在成年組中顯著下調(diào),是miR-1的靶基因之一,這些miRNA與它們的靶基因表達(dá)均呈反向負(fù)調(diào)控趨勢(shì)。

    3 討論

    大熊貓的營(yíng)養(yǎng)代謝一直是遺傳學(xué)家和進(jìn)化生物學(xué)家最感興趣的問(wèn)題。胰腺是動(dòng)物重要的消化器官,在消化和營(yíng)養(yǎng)代謝中起著至關(guān)重要的作用。分析幼年早期和成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達(dá),有助于了解不同年齡階段miRNA對(duì)大熊貓食物代謝的調(diào)控作用及其變化規(guī)律。

    本文鑒別到幼年早期大熊貓胰腺組織中特有表達(dá)的36個(gè)保守miRNA,主要參與合成及代謝的調(diào)控,包括含氮化合物、大分子化合物、核酸代謝過(guò)程的調(diào)控,暗示幼年早期大熊貓大分子合成較弱;而在成年大熊貓?bào)w內(nèi),這些miRNA的沉默表達(dá)可能促進(jìn)了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的合成過(guò)程。對(duì)DE miRNA的靶基因進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)成年組中上調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)Υ蠓肿雍秃衔锎x過(guò)程的調(diào)控是正調(diào)控作用,而成年組下調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)@些物質(zhì)合成的生物學(xué)過(guò)程主要是負(fù)調(diào)控。這與mRNA分析結(jié)果相吻合,即成年大熊貓胰腺組織中參與這些大分子合成的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(Ma.,2020)。

    生物體在正常營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(Poyton.,2009)。幼年早期大熊貓胰腺組織中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG富集到了活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)控通路上,說(shuō)明相較于成年大熊貓,幼年大熊貓活性氧代謝的能力較弱。研究表明,當(dāng)需求能量增加但攝入能量較少時(shí),會(huì)激活體內(nèi)脂肪的分解代謝,而造成細(xì)胞的活性氧代謝產(chǎn)物大量增加(張帆等,2020)。這一方面可能由于成年大熊貓代謝水平高(Ma.,2020),產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)多,另一方面可能由于幼年早期大熊貓從母體乳汁中攝入的能量較多,因此體內(nèi)活性氧化物質(zhì)較少,而成年大熊貓以竹子為食,竹子中所含能量物質(zhì)少,體內(nèi)脂肪代謝途徑可能被激活從而產(chǎn)生了較多的活性氧物質(zhì),提高活性氧物質(zhì)的代謝反應(yīng)以維持機(jī)體內(nèi)正常的活性氧化物水平。本研究結(jié)果表明,miRNA參與了成年大熊貓活性氧代謝的調(diào)控作用。

    幼年早期組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了蛋白質(zhì)消化吸收的通路上,而成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了氨基酸代謝的相關(guān)通路上。mRNA分析結(jié)果也顯示,成年大熊貓胰腺組織內(nèi)上調(diào)DEG富集到了與氨基酸和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的通路上,而在幼體大熊貓胰腺組織中的上調(diào)DEG富集到了與蛋白質(zhì)消化吸收有關(guān)的通路上(Ma.,2020),miRNA結(jié)果與mRNA分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)是幼體生長(zhǎng)發(fā)育期間所必需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Wiedmeier.,2011),蛋白質(zhì)利用率下降會(huì)導(dǎo)致哺乳期幼崽生長(zhǎng)受限(Aguinaga.,2011)。負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因的miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中低表達(dá),而在成年后高表達(dá),可能由于乳汁中蛋白質(zhì)含量高,幼年大熊貓對(duì)乳汁中蛋白質(zhì)吸收充分,以保證出生后的快速生長(zhǎng)。成年大熊貓調(diào)控氨基酸和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的miRNA下調(diào),可能是因?yàn)槌赡甏笮茇埓x水平的全面提高(Ma.,2020)。

    針對(duì)一些DE miRNA的功能分析發(fā)現(xiàn),它們可以調(diào)節(jié)許多重要的代謝過(guò)程,將這些代謝過(guò)程分為脂質(zhì)代謝、能量代謝以及蛋白質(zhì)代謝。其中,miR-27a、miR-122和miR-370與脂質(zhì)代謝有關(guān)。miR-27a可以促進(jìn)脂肪分解,釋放出更多的甘油及游離脂肪酸(Wang.,2011),它在成年大熊貓中的表達(dá)上調(diào)表明了成年大熊貓胰腺組織中的脂質(zhì)代謝較幼年早期個(gè)體有提高。miR-122可以參與脂類代謝,Esau等(2006)的研究表明,抑制 miR-122的表達(dá)對(duì)小鼠血漿的膽固醇和脂肪酸代謝均有促進(jìn)作用。成年大熊貓?bào)w內(nèi)miR-122的表達(dá)相較于幼年早期下降,也說(shuō)明成年大熊貓?bào)w內(nèi)的脂肪酸代謝較幼年早期旺盛。miR-370也在成年大熊貓?bào)w內(nèi)表達(dá)下調(diào)。miR-370對(duì)miR-122的表達(dá)具有正向調(diào)控作用;此外,miR-370還與miR-122的調(diào)控作用類似,可通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程(Iliopoulos.,2010)。這些miRNA的差異表達(dá)說(shuō)明,成年大熊貓?bào)w內(nèi)的脂質(zhì)代謝水平高,與 mRNA的研究結(jié)果一致。Li等(2011)研究顯示,包括miR-363、miR-382和miR-494等27個(gè)miRNA被預(yù)測(cè)為靶向參與氧化磷酸化的基因,且蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示miRNA與其靶基因呈反向表達(dá)。miR-494、miR-382和miR-363在成年大熊貓中的顯著下調(diào)可能促進(jìn)其能量代謝。此外,ATP合酶是氧化磷酸化過(guò)程中一個(gè)重要因子,而miR-127可以調(diào)控ATP合酶的亞基——ATP5B,miR-127靶向β-mRNA的3’UTR區(qū)域,并抑制ATP5B翻譯(Willers.,2012)。在成年組中,miR-127的表達(dá)下調(diào)保證了ATP合酶的生成,促進(jìn)了能量代謝。這一結(jié)果也與mRNA研究一致,即在成年大熊貓?bào)w內(nèi)的能量代謝較幼年早期旺盛(Ma.,2020)。目前,有關(guān)miRNA對(duì)動(dòng)物體內(nèi)氨基酸代謝過(guò)程中的調(diào)控研究較少,在差異表達(dá)的miRNA中僅發(fā)現(xiàn)miR-1對(duì)氨基酸代謝有調(diào)控作用。有研究表明,僅攝取10 g必需氨基酸后3 h內(nèi),miR-1的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)顯著上調(diào),從而加速氨基酸代謝與后期蛋白質(zhì)的合成(Mcgregor.,2014),miR-1在成年大熊貓胰腺組織中的表達(dá)上調(diào)可能與其相關(guān)代謝水平的提高有關(guān)。

    綜上,miRNA在大熊貓生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝的動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,miRNA的差異表達(dá)模式與幼年早期大熊貓對(duì)高營(yíng)養(yǎng)的需求和成年大熊貓胰腺組織中高水平的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和能量代謝相一致,這些結(jié)果與mRNA的分析一致。本研究豐富了大熊貓消化代謝的基礎(chǔ)研究,為進(jìn)一步了解大熊貓食性轉(zhuǎn)變與營(yíng)養(yǎng)利用提供了重要的參考。然而,由于研究對(duì)象及組織的特殊性,目前樣本量較小,因此后續(xù)可增加樣本量繼續(xù)開展深入研究,進(jìn)一步證實(shí)本研究的結(jié)果。

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