不同劑量多西紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的研究

羅維昊

摘要：目的：探討不同劑量的多西紫杉醇坐骨神經(jīng)旁誘導(dǎo)治療神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究。方法：選取SD大鼠40只，隨機(jī)分為：1.假手術(shù)組（FS組）：只解剖暴露坐骨神經(jīng)不置管給藥;2. 以 1∶ 1的聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇為載體組（TR組）;3.神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組（0.1mg）（L組）和神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組（1mg）（H組），每組10只。假手術(shù)組單純暴露坐骨神經(jīng)，載體組、神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組和神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組大鼠建立神經(jīng)旁置管模型。模型建立后，假手術(shù)組不予處理，生理鹽水組注射生理鹽水，神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組和神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組分別注射0.1mg、1mg多西紫杉醇。各組大鼠分別術(shù)前和術(shù)后 1、3、7、14、21 d測定50%機(jī)械刺激撤足閾值及熱刺激撤足潛伏期的影響，，ELISA檢測坐骨神經(jīng)中CGRP的表達(dá)。結(jié)果：給藥3 d、7 d后，神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組和神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組PMWT分別為（4.52±0.73） g和（5.53±0.70） g、（5.15±0.71） g和（6.35±0.80） g，PWL分別為（7.12±1.03） s和（8.31±1.20） s、（8.13±1.32） s和（9.20±1.21） s，明顯高于載體組（P<0.05）與假手術(shù)組（P<0.05）;其中神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組PMWT和PWL明顯高于神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組（P<0.05）。神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組和神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組脊髓背角CGRP表達(dá)量分別為（1.751±0.120）和（1.322±0.118），明顯高于載體組（P<0.05）與假手術(shù)組（P0.05）;其中神經(jīng)旁多西紫杉醇高劑量組明顯高于神經(jīng)旁多西紫杉醇低劑量組（P<0.05）。結(jié)論：高劑量多西紫杉醇制備神經(jīng)病理性疼痛模型更為穩(wěn)定，其機(jī)制可能與CGRP表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：多西紫杉醇;化療并發(fā)癥;神經(jīng)病理性疼痛

【Abstract】Objective： to investigate the effect of different docetaxel doses on neuropathic pain induced by SCIATIC nerve. Methods： 40 SD rats were randomly divided into 4 groups： 1. Sham-operation Group （FS group） ： Only anatomically exposed sciatic nerve were given without indwelling tube; 2. 1∶1 castor oil of polyoxyethylene and anhydrous ethanol as carrier Group （T Group） ; 3. The low-dose group （0.1 mg） and the high-dose Group （1 mg）（h group） of Paclitaxel were 10 rats in each group. The rats in sham-operation group were exposed to Sciatic nerve alone， and the rats in carrier group， low-dose Group and high-dose Group were subjected to nerve-side Catheterization. After the model was established， the sham-operation group was not treated， the normal saline group was injected， the low-dose Group and the high-dose group were injected with 0.1 mg and 1 mg respectively. Before and 1，3，7，14，21 days after operation， 50% mechanical stimulus withdrawal threshold and the influence of thermal stimulus withdrawal latency were measured， and the expression of CGRP in Sciatic nerve was detected by Elisa. Results： After 3 D and 7 D administration， the PMWT in low dose group and High Dose Group were （4.52 ± 0.73） G， （5.53 ± 0.70） G， （5.15 ± 0.71） G and （6.35 ± 0.80） G， respectively， pWL was （7.12 ± 1.03） s and （8.31 ± 1.20） s， （8.13 ± 1.32） s and （9.20 ± 1.21） S， respectively， which were significantly higher than those in carrier group （p < 0.05） and Sham Operation Group （p < 0.05） ?PMWT and PWL in the high dose group were significantly higher than those in the low dose group （p < 0.05） . The expressions of CGRP in the Dorsal Horn of spinal cord in the low dose group and High Dose Group were （1.751 ± 0.120） and （1.322 ± 0.118） ， respectively， which were significantly higher than those in the carrier group （p < 0.05） and Sham Operation Group （P0.05） ?The high-dose Group was significantly higher than the low-dose group （p < 0.05） . Conclusion： The model of neuropathic pain induced by high dose Docetaxel is more stable， and the mechanism may be related to the expression of CGRP.

【Keyword】Docetaxel; complications of Chemotherapy; neuropathic pain

多西紫杉醇是半合成紫杉烷的一種，作為常見化療藥用于許多實(shí)體腫瘤的治療[1]?；煂?dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛（CIPN）是限制多西紫杉醇治療劑量的主要不良反應(yīng)[2]。此外，多西紫杉醇引起的周圍神經(jīng)病疼痛通常演化為一種慢性疾病，難以治愈，進(jìn)而影響癌癥幸存者的生活質(zhì)量[3-4]。多西紫杉醇主要利用與微管的 β-微管蛋白結(jié)合發(fā)揮抗癌作用，從而使細(xì)胞周期阻滯和發(fā)生凋亡。然而，多西紫杉醇引起的機(jī)械性異位疼痛的原理機(jī)制尚未研究清楚。

目前，化療藥物制備模型的方法主要包括腹腔注射，靜脈注射已經(jīng)神經(jīng)旁注射，腹腔注射的優(yōu)勢在于藥物吸收穩(wěn)定，操作簡單，大鼠耐受性較好，然而CIPN的制備難度較高，造模不穩(wěn)定[4]，尾靜脈注射藥物濃度計(jì)量可控，效果尚可，然而大鼠配合難度較大，長期用藥較困難，需麻醉后置入靜脈導(dǎo)管[5]，最近的研究當(dāng)中，一次性埋入凝膠海綿導(dǎo)管后多次給藥簡便，精準(zhǔn)給藥對比較為明確，因此本課題擬對神經(jīng)旁給藥建模濃度進(jìn)行評價(jià)。

材料與方法

1. 大鼠

實(shí)驗(yàn)采用雄性的SD大鼠， 體重150 -170 g， 由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)， 自由飲食， 室溫保持在 （24±1） ℃和 50% -60%的濕度， 12 h -12 h白天 -黑夜循環(huán)照明 。假手術(shù)組 （FS 組，n = 10） 只分離暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行其他處理;載體組（TR組，n = 10）只暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)置管后給予空白載體;低劑量多西紫杉醇組（L組， n = 10）暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)后置管建立CIPN模型;高劑量多西紫杉醇組（H 組，n = 10）暴露坐骨神經(jīng)周圍置管建立CIPN模型。

2. 藥物

藥品及試劑： 多西紫杉醇，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號 0811201。溶劑聚氧乙基蓖麻油 /無水乙醇 （1∶1）。兔抗人PGP9. 5多抗，Abcam 公司，德國; 小鼠抗大鼠 MHCclass II RT la （OX-6 ） 單抗，Abcam公司，德國; Cy3標(biāo)記驢抗兔 IgG，Bio公司，美國; FITC標(biāo)記驢抗小鼠IgG，Cruz公司，德國。

3. 坐骨神經(jīng)旁置管模型制備與給藥坐骨神經(jīng)附近的導(dǎo)管埋入

以 Chacur等[6]的實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)加以進(jìn)一步的改進(jìn)。裁剪明膠海綿為成20 mm長 、 4 mm寬 、10mm高的長塊狀。切開 1端并分成兩半然后置入1根 5 cm長的 PE-10管， 套線將 PE-10管與明膠海綿結(jié)扎加固在一起。70%乙醇浸泡 15 min， 無菌超凈臺(tái)吹干備用。大鼠用10%水合氯醛麻醉 （3.5 mL/kg， ip）， 然后于右后肢備皮消毒。將明膠海綿包裹覆蓋于分離好的右側(cè)坐骨神經(jīng)上， 通過PE-10管注入0.1mg/1mg多西他賽或載體。每天1次， 共21d。

4. 行為學(xué)測試

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)與給藥分別交由不同的志愿者。大鼠放在升高的鐵絲網(wǎng)上，限制其活動(dòng)范圍于透明有機(jī)玻璃盒（40 cm × 15 cm × 20cm）下方，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)于自由活動(dòng)10min后開始。機(jī)械性異常性疼痛、機(jī)械性痛覺過敏分別通過4g和15g折力的測痛絲進(jìn)行測試。每只大鼠折力由小到大的順序進(jìn)行測試時(shí)。測痛絲刺激大鼠后足掌底中部5 s，每種折力的測痛絲刺激每只后足5次，每只大鼠共刺激10次。大鼠兩只后足對 4g、15 g 測痛絲刺激的反應(yīng)次數(shù)和總刺激次數(shù)的百分比分別作為該只大鼠的機(jī)械性異常性疼痛、機(jī)械性痛覺過敏的程度。

5. 熱刺激撤足潛伏期的測定

使用熱平板測試儀檢測大鼠后肢足跟部皮膚對熱傷害性刺激的反應(yīng)。測試前將大鼠放置于平板測試儀的有機(jī)玻璃箱內(nèi)約5min， 測試時(shí)將可移動(dòng)的熱輻射光源通過透明玻璃板輸出紅外線熱刺激并聚焦于大鼠后肢足跟部。熱刺激強(qiáng)度以正常大鼠光照10 s-15 s左右出現(xiàn)撤足反應(yīng)為宜。在大鼠撤足的瞬間或人為設(shè)定熱刺激25 s（為防止長時(shí)間熱刺激燙傷大鼠）， 熱光源自動(dòng)關(guān)閉， 計(jì)時(shí)器自動(dòng)停止， 可準(zhǔn)確記錄下大鼠的熱刺激撤足潛伏期。以 5 min的間隔對雙側(cè)后足各測3次， 3次撤足潛伏期的均值用于最后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6. CGRP檢測

分別于造模后1、3、7和21d時(shí)每組隨機(jī)取5 只大鼠，采用免疫熒光法測定背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 CGRP表達(dá)水平。腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg麻醉后，37℃生理鹽水經(jīng)大鼠心臟灌注沖洗，后經(jīng)4℃4%多聚甲醛灌流固定，取坐骨神經(jīng).放人4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中后固定 6-8 h，再放入30%蔗糖中4℃過夜。待組織固定后行冰凍切片，切片厚度約20μm。3%小牛血清室 溫封閉2 h后，滴加羊抗CGRP一抗，4℃孵育24 h;滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h，10%甘油封片。采用熒光顯微鏡獲取圖片。每組隨機(jī)選取6～8張切片，每張切片取3～5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性神經(jīng)元，CGRP陽性神經(jīng)元呈綠色熒光，取其平均值反映蛋白表達(dá)水平。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，資料數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 （x±SD） 表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)資料的t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

2.1體重

多西紫杉醇對SD大鼠一般情況的影響實(shí)驗(yàn)期間未觀察到5組大鼠出現(xiàn)脫毛、腹瀉、運(yùn)動(dòng)失常等情況。每2 d或3d 測定大鼠體重一次。從圖 1的體重動(dòng)態(tài)觀測表中可以看出，坐骨神經(jīng)旁給藥5次多西紫杉醇對 SD大鼠的體重增長沒有明顯的影響。

2.2各組大鼠機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值（PWMT） 和熱刺激縮足反應(yīng)閾值（PWTL）

行為學(xué)的改變與FS組和同時(shí)間點(diǎn)的CR組相比，L組與H組在術(shù)后 3 ～ 21 d 機(jī)械痛閾和熱痛閾均明顯降低，其中以14天時(shí)降低最為明顯，21 天時(shí)有升高的趨勢，結(jié)果提示CIPN模型建立成功。L組與R組相比，H組PWMT和PWTL明顯上升（P < 0.05）。提示較高劑量多西紫杉醇更易表現(xiàn)為CIPN癥狀（見表2、3）。FS組與TR組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）。

2.3CGRP表達(dá)水平

與FS組以及TR組比較，L組與H組在術(shù)后 3～21 d CGRP水平皆有降低，后期下降較為平緩。L組與H組相比，H組PWMT和PWTL明顯上升（P < 0.05）。提示較高劑量多西紫杉醇更易表現(xiàn)為CIPN癥狀（見表2、3）。FS組與TR組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）。

討論

多西紫杉醇是從短葉紅豆樹皮中分離出來的化療藥物。其常見的毒副作用有： 1.骨髓抑制;2.腎毒性;3.外周神經(jīng)毒性。骨髓抑制和腎毒性可以通過粒細(xì)胞集落刺激因子和大量飲水處理。但是，外周神經(jīng)毒性由于機(jī)制研究并不完善缺乏有效治療手段，是其重要的劑量限制因素。

多西紫杉醇可導(dǎo)致患者的感受神經(jīng)元異常和神經(jīng)痛等的嚴(yán)重的化療藥導(dǎo)致的外周神經(jīng)病變，包括機(jī)械性異常性疼痛、冷敏異常性疼痛、持續(xù)性灼燒痛、機(jī)械痛覺過敏麻刺感和麻木等癥狀，且這些癥狀不會(huì)隨著化療藥的停藥而得到緩解，而是持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年[2]。同時(shí)，因?yàn)镃IPN多對目前臨床上所使用的鎮(zhèn)痛藥物不敏感，ke能會(huì)使部分患者被迫減少化療藥的劑量甚至停藥，繼而影響化療效果甚至使化療歸于失敗。研究顯示，CIPN 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明，也沒有可以有效緩解或治療 CIPN 的藥物問世[4，5]。

有研究使用多西紫杉醇腹腔注射建立SD大鼠外周神經(jīng)病變模型，然而建立條件及方法差異較大（如給藥劑量、給藥頻率、動(dòng)物品系、測定方法等）。甚至不同品種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)CIPN有效藥物時(shí)亦有不同表現(xiàn)，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。部分研究采用了 Wistar 大鼠、C57BL /6和ddY等小鼠作為模型動(dòng)物[4-8]。SD大鼠仍是當(dāng)前采用較多的 CIPN 模型動(dòng)物。

研究 CIPN的常用方法包括機(jī)械縮足反射、熱敏實(shí)驗(yàn)和冷敏實(shí)驗(yàn)。對各種文獻(xiàn)薈萃發(fā)現(xiàn)，選擇機(jī)械縮足反射測定特定刺激力度縮足比率的報(bào)道比例最大，該實(shí)驗(yàn)周期較長 （約為 20～30 d） [5，9，10，11]，較為符合實(shí)際情況，結(jié)果相對真實(shí);采用機(jī)械縮足反射測定縮足閾值的報(bào)道相對較少，且實(shí)驗(yàn)周期較短（5～7 d） ，適合作為預(yù)實(shí)驗(yàn)或初步CIPN藥物的篩選。

本研究選擇了貼近臨床狀態(tài)的機(jī)械縮足反射測定特定刺激力度縮足比率的方法。采用機(jī)械縮足反射法測定大鼠疼痛常用 4 -15 g 折力的測痛絲。因?yàn)檎４笫笫艿?4 g 折力測痛絲的刺激發(fā)生縮足反射的頻率很低，而CIPN模型大鼠受到4 g折力的刺激會(huì)出現(xiàn)明顯的縮足反射，因此4 g折力對大鼠足底的刺激所引起的反應(yīng)最能夠代表機(jī)械性異常性疼痛。正常大鼠受到15 g折力的測痛絲刺激后約5～20%的幾率發(fā)生縮足反射，而CIPN模型大鼠受到 15 g 折力的刺激出現(xiàn)縮足反射的幾率明顯上升，因此15 g折力的測痛絲對大鼠足底的刺激所引起的反應(yīng)最能代表機(jī)械性痛覺過敏[12]。

本研究在不損傷神經(jīng)的情況下， 坐骨神經(jīng)周圍給予不同劑量的多西紫杉醇可引起大鼠右側(cè)后爪機(jī)械刺激和熱刺激痛覺過敏， 持續(xù)約20 d。即外周神經(jīng)未產(chǎn)生物理性的損傷， 疼痛也可以產(chǎn)生。將載體溶劑與坐骨神經(jīng)旁注射也可引起痛覺過敏[ 8]，這是由于激活了坐骨神經(jīng)周圍免疫反應(yīng) [ 9] 。而正常周圍神經(jīng)免疫系統(tǒng)的激活已足以引起疼痛 [ 9， 10] ，較高劑量的多西紫杉醇效果進(jìn)一步加強(qiáng)。一些研究顯示低計(jì)量的多西紫杉醇可以制備出類似神經(jīng)損傷以后產(chǎn)生的疼痛行為學(xué)變化，引起雪旺氏細(xì)胞脫分化， 激活巨噬細(xì)胞等等 [ 13] 。坐骨神經(jīng)周圍包裹明膠海綿再給予多西紫杉醇引起的痛覺過敏可以持續(xù) 20 d左右。這可能是由于給藥方式的不同導(dǎo)致的。 本研究報(bào)道坐骨神經(jīng)旁給予化療藥物建立的動(dòng)物模型相對穩(wěn)定、可靠，為進(jìn)一步研究 CIPN 發(fā)生的機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)

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基金來源：腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)種子基金 （1906-1）