青蒿琥酯誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡作用研究

尤楊 曲藝 劉亮

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，對人們的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-3]。肺腺癌是肺癌常見的病理類型，占肺癌的主要組能部分。目前，肺腺癌常規(guī)的治療方法包括手術(shù)、化學(xué)藥物治療及放射治療。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以顯著提高肺腺癌患者的生活質(zhì)量及生存期。部分患者就診時已是中晚期，失去手術(shù)治療的最佳時期，化學(xué)藥物治療將成為其主要的治療方法之一。影響化療療效的主要因素包括藥物的毒副作用及腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥。因此，探尋高效低毒的抗肺腺癌藥物具有重要意義。在腫瘤治療史上，中草藥對于腫瘤的治療具有重要的意義，且具有獨特的低毒不良反應(yīng)的特點[4-6]，青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，來源于植物黃花蒿。青蒿素具有特異的抗瘧作用，被廣泛應(yīng)用于臨床治療瘧疾。青蒿琥酯作為青蒿素的衍生物，具有特異的抗瘧作用，且對于重型及耐藥型瘧疾治療效果甚佳[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯除具有特異的抗瘧作用外，還具有較多的其他生物活性，如抗腫瘤[10,11]，調(diào)節(jié)免疫力[12]及抗動脈粥樣硬化[13]等生物活性。目前有較多文獻(xiàn)報道了青蒿琥酯的抗腫瘤作用，其對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用，本研究在以往的實驗中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對消化道腫瘤(胃癌及食管癌等)細(xì)胞具有生長抑制作用，其作用機制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯有關(guān)[14,15]，但青蒿琥酯抑制肺腺癌細(xì)胞生長作用的研究筆者所見鮮有報道。本研究探討青蒿琥酯抗肺腺癌作用及其相關(guān)的作用機制，為臨床肺腺癌治療提供高效低毒的藥物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，美國Beckman Coulter公司；青蒿琥酯(60 mg，批號:LA150444)，中國桂林南藥股份有限公司；活性氧檢測試劑盒，中國碧云天生物技術(shù)公司；流式細(xì)胞儀(FC500型)，美國Beckman Coulter公司。

1.2 MTT 實驗方法檢測青蒿琥酯對肺腺癌A549細(xì)胞生長抑制率 調(diào)整肺腺癌A549細(xì)胞懸液濃度至5×104個/ml，按照每孔0.2 mlA549細(xì)胞懸液量接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，代細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的Art (0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，每個藥物劑量重復(fù)3個復(fù)孔，待藥物作用24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，而后棄去培養(yǎng)液，每孔加入180 μl DMSO，振蕩10 min。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定光密度值A(chǔ)490。生長抑制率 (%)=(1-用藥組A490/對照組A490)×100%。

1.3 青蒿琥酯干預(yù)肺腺癌A549細(xì)胞實驗 將處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞(濃度為1.25×106/ml)4 ml 接種于培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的Art，使終濃度分別達(dá)到25、50、100 μg/ml，分別命名為25、50、100 μg/ml Art組。實驗重復(fù)3次。對照組使用0.9%氯化鈉溶液代替Art。作用時間為24 h。而后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。

1.4 Art干預(yù)A549細(xì)胞后FCM檢測細(xì)胞凋亡率 將1.3實驗步驟中制備的單細(xì)胞懸液1 ml(含1×106個細(xì)胞)，使用PBS液洗滌1次，去上清，加入100 μl 1×binding buffer，而后加入5 μl Annexin V-FITC，避光放置15 min，加入1×binding buffer 390 μl及PI 5 μl， 避光放置15 min，使用流式細(xì)胞儀(FC500型，Beckman Coulter)檢測。

1.5 FCM檢測Art干預(yù)A549細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)活性氧 將1.3實驗步驟中制備的單細(xì)胞懸液1 ml(含1×106個細(xì)胞)，使用PBS液洗滌1次，去除上清液，加入熒光探針10 μmol/L DCFH-DA，在37℃下避光染色20 min，PBS洗滌細(xì)胞1次后，1 ml PBS液懸浮細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測。

1.6 FCM檢測Art干預(yù)A549細(xì)胞后Caspase-3蛋白 將1.3實驗步驟中制備的單細(xì)胞懸液1 ml(含1×106個細(xì)胞)使用PBS液洗滌1次，將上清液棄去，加入100 μl PBS液，加入100 μl Caspase-3抗體，避光放置30 分鐘，而后加入100 μl二抗，避光放置30 min后加入10 ml PBS液,1 000轉(zhuǎn)5 min離心，去上清，加入1 ml PBS液，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長作用 不同濃度青蒿琥酯(濃度范圍0.1～800 μg/ml)作用肺腺癌A549 細(xì)胞24 h后，出現(xiàn)不同程度A549細(xì)胞生長抑制，青蒿琥酯對A549細(xì)胞生長抑制作用具有青蒿琥酯濃度依賴性(P<0.01)，800 μg/ml Art組與0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400 μg/ml Art組相比，A549細(xì)胞生長抑制率顯著增高(P<0.01)。青蒿琥酯作用A549細(xì)胞24 h的IC50值為(52.87±2.36)μg/ml。見表1。

表1 青蒿琥酯抑制肺癌細(xì)胞生長

2.2 青蒿琥酯誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用 不同濃度的青蒿琥酯(濃度范圍25～100 μg/ml)作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h后，A549細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度細(xì)胞凋亡，且青蒿琥酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用具有青蒿琥酯濃度依賴性。(25、50、100 μg/ml)青蒿琥酯組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)。100 μg/ml青蒿琥酯組A549細(xì)胞凋亡率顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組A549細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。見表2。

表2 青蒿琥酯作用后A549細(xì)胞凋亡率

2.3 青蒿琥酯調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)水平作用 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h，與對照組相比，細(xì)胞活性氧水平顯著增高(P<0.05)。100 μg/ml青蒿琥酯組與25及50 μg/ml青蒿琥酯組相比，A549細(xì)胞活性氧水平顯著增高(P<0.01)，青蒿琥酯可以顯著上調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)水平，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。見表3。

表3 青蒿琥酯上調(diào)肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)水平

2.4 青蒿琥酯調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá) 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯組與對照組相比，A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，且具有青蒿琥酯濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)，青蒿琥酯可以顯著上調(diào)A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。見表4。

表4 青蒿琥酯調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病及死亡率均居惡性腫瘤的首位[16-18]。肺腺癌是肺癌常見的病理類型。目前，肺腺癌的主要治療包括，手術(shù)、化學(xué)藥物治療及放射治療。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以顯著提高肺腺癌患者的生活質(zhì)量及生存期。部分患者就診時已是中晚期，失去手術(shù)治療的最佳時期，化學(xué)藥物治療將成為其主要的治療方法之一?；熎陂g，藥物的毒副作用及腫瘤細(xì)胞對藥物的耐藥嚴(yán)重影響化療療效，因此，急需探尋低毒、高效的抗肺腺癌藥物。在腫瘤治療史中，中草藥治療腫瘤占據(jù)重要的地位，且中草藥具有價廉、低毒等優(yōu)點。因此，從中草藥中尋找抗腫瘤藥物，具有重要意義。

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物[19-21]，青蒿素來源于植物黃花蒿。青蒿琥酯作為青蒿素的衍生物，具有特異的抗瘧作用，且對于重型及耐藥型瘧疾治療效果甚佳[22-25]。進(jìn)一步的研究顯示，青蒿琥酯還具有其他生物活性，例如抗腫瘤[26]、抗炎[27]、抗病毒[28]、抗動脈粥樣硬化[13]等生物活性。文獻(xiàn)顯示，青蒿琥酯可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期，從而起到抗腫瘤作用[29]，本研究顯示，青蒿琥酯可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制食管癌及胃癌細(xì)胞生長，起到抗食管癌及胃癌作用[14,15]。Dong等[30]研究顯示，青蒿琥酯可以抑制裸鼠接種MCF-7細(xì)胞皮下移植瘤生長，其作用機制與誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期周期阻滯及細(xì)胞凋亡有關(guān)。Holien等[31]研究顯示，青蒿琥酯在安全劑量下可以誘導(dǎo)淋巴瘤及骨髓瘤細(xì)胞生長停滯及細(xì)胞凋亡，沒有嚴(yán)重的毒副作用。Pang等[32]研究顯示，青蒿琥酯可以引起肝癌細(xì)胞凋亡從而起到抗肝癌的作用，其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用機制與調(diào)控活性氧誘導(dǎo)Bax依賴的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡有關(guān)。Li等[33]研究顯示，青蒿琥酯通過抑制Wnt/beta-catenin 通路的活性，從而抑制結(jié)直腸癌生長。本研究青蒿琥酯抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長抑制作用機制，為將青蒿琥酯用于抗肺腺癌藥物提供實驗基礎(chǔ)。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的穩(wěn)態(tài)對于維持機體正常組織生長具有重要意義，一但穩(wěn)態(tài)失衡就會引起疾病發(fā)生，包括腫瘤的發(fā)生。Kaczanowski等[34]綜述了細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡紊亂引起腫瘤。Tenorio等[35]研究顯示，細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白和細(xì)胞周期蛋白在牙源性上皮性病變中表達(dá)不同，其表達(dá)可能與成釉細(xì)胞瘤(AMB)、牙源性角化囊腫(OKC)和牙源性腺瘤樣腫瘤(AOT)的生物學(xué)行為有關(guān)。Evan等[36]綜述了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡與癌癥的關(guān)系，顯示細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的紊亂參與了癌癥的發(fā)生及發(fā)展。以上研究顯示，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，因此，目前在尋找新的抗腫瘤藥物中，將藥物是否能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為藥物是否具有抗腫瘤作用的觀測點之一。Wang等[37]研究顯示，敲低胰腺癌細(xì)胞中KDM1B基因表達(dá)，可以抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制胰腺癌的進(jìn)展。Lin等[38]研究顯示，Bakuchiol可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，起到抗胃癌的作用。Jalali等[39]研究顯示，Kefir可以抑制人急性紅白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而有可能是治療人急性紅白血病的一種有效的方法。Ramdani等[40]研究顯示，Spiro-bisheterocycles可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而可以將Spiro-bisheterocycles開發(fā)為抗乳腺癌藥物。以上的研究均顯示了，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以起到抗腫瘤的作用。本研究利用MTT實驗檢測到，Art抑制A549細(xì)胞生長，且具有Art濃度依賴性。計算半數(shù)抑制濃度(IC50值)為52.87 μg/ml，因此后續(xù)實驗中選擇了25、50、100 μg/ml青蒿琥酯進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)實驗。AnnexinV/PI雙染細(xì)胞利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡已是細(xì)胞凋亡檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，文中檢測到青蒿琥酯作用A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，青蒿琥酯濃度越大細(xì)胞凋亡率越高，此實驗結(jié)果與以往研究的青蒿琥酯誘導(dǎo)食管癌及胃癌細(xì)胞凋亡作用結(jié)果[14,15]一致。

活性氧(reactive oxygen species)是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，活性氧的平衡維持機體細(xì)胞正常功能，一旦機體中活性氧增多就會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙引起疾病。過量的活性氧的主要靶細(xì)胞器為線粒體，可以誘導(dǎo)線粒體雙層膜通透孔開放，釋放鈣離子、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子AIF等引起胱冬蛋白酶Caspase-3等激活，使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Prasad 等[41]綜述了活性氧在癌癥發(fā)展的各個階段中的作用，活性氧的紊亂參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，且顯示從大自然中提取的營養(yǎng)制劑可以通過調(diào)控活性氧從而起到抗癌作用。Moloney等[42]研究顯示，活性氧信號通路與癌癥發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本研究中檢測到青蒿琥酯作用后，A549細(xì)胞出現(xiàn)活性氧增多，而且具有青蒿琥酯劑量依賴性。提示，青蒿琥酯可以提高A549細(xì)胞中活性氧表達(dá)量，引起細(xì)胞凋亡。

Caspase 3是一種蛋白酶，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspase 3活化可以引起核酸內(nèi)切酶的活化，引起細(xì)胞凋亡。Huang等[43]研究顯示，Solanum nigrum polysaccharides可以抑制肝癌細(xì)胞H22荷瘤小鼠的瘤體生長，其抑瘤作用機制與上調(diào)細(xì)胞中caspase-3表達(dá)及下調(diào)bcl-2表達(dá)有關(guān)。Yao等[44]研究顯示，Boschniakia Rossica Polysaccharide通過調(diào)控喉癌細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3及P53表達(dá)，引起喉癌細(xì)胞凋亡，從而起到抑制喉癌細(xì)胞生長作用。Pengju等[45]研究顯示，NKX3.1通過增加Caspase-3的表達(dá)及其活性增強TNF-αlpha/CHX誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，從而起到抗前列腺癌作用。以上研究顯示，增加Caspase-3的表達(dá)及其活性可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用。Art干預(yù)后，A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。Caspase-3表達(dá)量增高可以引起不可逆性細(xì)胞凋亡。

綜上所述，青蒿琥酯對肺腺癌A549細(xì)胞具有生長抑制作用，其作用機制為青蒿琥酯上調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)活性氧及Caspase-3蛋白表達(dá)，導(dǎo)致A549細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。我國是具有藥用效果青蒿素的主要產(chǎn)地，青蒿琥酯來源于青蒿素是其衍生物之一，能保證青蒿琥酯的高產(chǎn)量。