非洲豬瘟疫苗及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)應(yīng)答研究進(jìn)展

袁夢(mèng)淇，馬玉騰，王 濤，孫 元，李永鋒，仇華吉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）感染家豬和野豬引起的一種高度接觸性傳染病，不同日齡的豬均易感。急性型ASF 臨床表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺和各臟器出血，病死率可高達(dá)100%，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將ASF 列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[2]。2018 年8 月，遼寧省沈陽市暴發(fā)了我國(guó)首例ASF 疫情，隨后蔓延至我國(guó)各省[3]。由于目前尚無商品化的疫苗及治療藥物，所以ASF 的防控主要依靠檢疫、撲殺以及嚴(yán)格的生物安全等措施。

ASFV 是非洲豬瘟相關(guān)病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的成員，是一種基因組龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙股線狀DNA 病毒。病毒粒子直徑約為260 nm～300 nm[4]，具有二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由基因組、內(nèi)核心殼、雙層內(nèi)膜、衣殼和外層囊膜構(gòu)成。其基因組全長(zhǎng)170 kb～194 kb，中央為長(zhǎng)約125 kb的保守區(qū)，左端48 kb和右端22 kb為可變區(qū)，左右可變區(qū)主要是多基因家族（Multigene families，MGFs）100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530 以及p22 家族組成（圖1），這也是不同分離株基因組長(zhǎng)度存在差異的主要原因[5]。根據(jù)ASFV p72（B646L）基因末端的差異，可以分為24 個(gè)基因型。根據(jù)紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)，可分為8 個(gè)血清群，其中我國(guó)流行的ASFV 屬基因II 型，血清群8，且不同的基因型和血清群之間差異很大，增加了ASF 疫苗研發(fā)的難度[6-7]。ASFV 主要感染單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，通過肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用侵入巨噬細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制、組裝以及子代病毒顆粒的釋放。ASFV 與其它大型DNA 病毒一樣，具有逃避或抑制宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制[8-12]。由于病毒可以依賴于特定基因表達(dá)的機(jī)制專門操縱宿主的免疫應(yīng)答致其發(fā)病機(jī)制變得更加復(fù)雜[13-14]，比如ASFV 基因組編碼了許多參與病毒組裝、DNA 復(fù)制和修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)的蛋白，如調(diào)控I 型干擾素（Interferon I，IFN-I）和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[15]。ASFV 編碼超過165種蛋白，雖然目前已鑒定出68種結(jié)構(gòu)蛋白，但仍有將近半數(shù)的ASFV 基因組編碼的蛋白功能未知[16]。ASFV因其基因類型多，數(shù)量龐大，大多數(shù)蛋白質(zhì)功能未知，免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜多樣，可逃避宿主免疫細(xì)胞的清除，所以一直未研制出有效的ASF 疫苗。但一些正在研究的ASF 疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中卻表現(xiàn)出一定的保護(hù)效力（表1），因此本綜述總結(jié)了ASF 各類疫苗的最新研究進(jìn)展及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)反應(yīng)，以期為研制出安全有效的ASF商品化疫苗提供借鑒。

表1 不同類型ASF疫苗及免疫保護(hù)相關(guān)指標(biāo)

圖1 ASFV基因組結(jié)構(gòu)示意圖

1 ASF 疫苗最新研究進(jìn)展

1.1 滅活疫苗滅活疫苗是最經(jīng)典的疫苗，免疫后可使機(jī)體產(chǎn)生基于體液免疫的免疫保護(hù)反應(yīng)，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和、清除病原微生物的作用。早期ASF 疫苗的研究主要聚焦于滅活疫苗，通過加熱、結(jié)晶紫、復(fù)方碘溶液、甲苯或甲醛等理化方式對(duì)ASFV 滅活[24]。但即使分別輔以新型佐劑PolygenTM或Emulsigen?-D 佐劑與疫苗乳化后接種的豬也不能抵御同源強(qiáng)毒株Armenia 08 的攻擊[25]。在誘導(dǎo)對(duì)清除病毒感染的細(xì)胞至關(guān)重要的特異性細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞方面，滅活疫苗也未顯示出明顯的效果[26]。因此，滅活疫苗不適用于ASF 的防控。但研制新的佐劑、采用新的或更無害的滅活程序則有助于提高滅活疫苗的效力。

1.2 亞單位疫苗和病毒活載體疫苗亞單位疫苗具有抗原蛋白高表達(dá)、低成本和高安全性等優(yōu)點(diǎn)，ASF 亞單位疫苗的研究策略主要是在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)ASFV 抗原基因，然后將表達(dá)的蛋白或多肽遞呈到抗原遞呈細(xì)胞（APCs）中，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ASFV 的抗體。病毒活載體疫苗由于缺失毒力基因或者復(fù)制必需基因，致使病毒無法復(fù)制，安全性較高，且病毒載體具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和高表達(dá)水平等特點(diǎn)，可以高效表達(dá)病毒的免疫原性蛋白，一般而言，該類型疫苗的保護(hù)效力較高。因此，研制表達(dá)ASFV 免疫原性良好基因的病毒活載體疫苗也是ASF 疫苗的一個(gè)研究方向。目前常用的病毒載體主要有腺病毒（Adenovirus）、痘病毒（Poxvirus）以及甲病毒（Alphavirus）等。此外，病毒活載體疫苗還具有區(qū)分病毒感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物（Differentiating infected from vaccinated animals，DIVA）的優(yōu)勢(shì)。最近的研究表明，用單獨(dú)表達(dá)ASFV 8 個(gè)蛋白（B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R）的重組腺病毒混合后首免、再用重組痘病毒（單獨(dú)表達(dá)上述8 個(gè)ASFV 蛋白）加強(qiáng)免疫的策略免疫豬，經(jīng)ASFV 強(qiáng)毒株OUR T88/1 攻毒后可以為豬提供100%的免疫保護(hù)[20]。將表達(dá)ASFV 7 個(gè)蛋白（A151R、B119L、B602L、K205R、B438L、A104R和EP402RΔPRR）的重組腺病毒通過“雞尾酒”式混合后免疫豬，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性IgG免疫應(yīng)答[27]，同時(shí)還產(chǎn)生了強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。表明該新型方式免疫能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生較全面的免疫應(yīng)答。利用桿狀病毒分別表達(dá)免疫原性良好的ASFV p30 和p54 蛋白，混合免疫后可在豬體內(nèi)檢測(cè)到中和抗體，且經(jīng)ASFV 強(qiáng)毒株E75 攻毒后免疫豬能夠全部存活[28]。但利用桿狀病毒系統(tǒng)分別表達(dá)p54、p30、p72 和p22 蛋白，混合后免疫豬，雖然產(chǎn)生了中和抗體，卻不能完全抵抗強(qiáng)毒株P(guān)retoriuskop/96/4的攻擊[17]。疫苗的免疫效果不一致推測(cè)可能是由于疫苗類型、疫苗接種策略、使用的抗原和誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不同等所致。

1.3 天然或人工弱毒疫苗弱毒疫苗是一類將病毒的致病力減弱但仍具有免疫原性的疫苗，可分為天然或人工弱毒疫苗。因其具有與病原最接近的生物學(xué)特征，所以可以誘導(dǎo)機(jī)體完全的免疫反應(yīng)。疫苗接種宿主后，可以誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)B 細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，清除血液中的病原顆粒，阻止病原進(jìn)入宿主細(xì)胞；除此之外，接種的疫苗還能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞，激活機(jī)體T 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而識(shí)別、殺滅被病原侵入的宿主細(xì)胞。但是部分ASFV 弱毒疫苗，還需解決有效性及安全性等問題才有望成為安全高效的ASF 弱毒疫苗。

1.4 基因缺失疫苗研究表明，同時(shí)缺失ASFV 弱毒株OUR T88/3 中的NL（DP71L）與UK（DP96R）基因后免疫豬，再分別利用同源OUR T88/3 和同源強(qiáng)毒株OUR T88/1 攻毒，結(jié)果免疫豬的存活率分別為100%和66%，表明基因缺失疫苗可對(duì)免疫豬提供良好的保護(hù)[29]。早期研究也表明，接種低毒力ASFV的豬可以抵抗同源強(qiáng)毒株的致死性攻擊，但面對(duì)異源病毒株的攻擊，即使免疫豬產(chǎn)生了抗體也不能對(duì)其提供完全的保護(hù)[30-31]。通過使用同時(shí)缺失9GL（B119L）和UK 基因的致弱株免疫豬，再利用親本病毒攻毒，結(jié)果在攻毒2 周后便可對(duì)豬提供免疫保護(hù)[22]。將缺失9GL 基因的ASFV Georgia 2007 株，以低劑量（102HAD50/mL～103HAD50/mL）免疫豬后能夠完全抵抗親本病毒的攻擊[32]。最近報(bào)道，以ASFV Pig/HLJ/2018 株為骨架構(gòu)建缺失MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L 和CD2v 7個(gè)基因的ASFV 基因缺失疫苗（HLJ/18-7GD），以高劑量（107.7TCID50/mL）接種豬后可對(duì)其提供抵抗ASFV 強(qiáng)毒株致死性攻擊的能力[33]。將缺失I177L 基因的Georgia 2007 株以102HAD50/mL～106HAD50/mL 的劑量免疫豬后未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和排毒現(xiàn)象，且能抵抗親本病毒的致死性攻擊[23]，上述結(jié)果表明缺失某個(gè)或數(shù)個(gè)毒力基因的ASF 基因缺失疫苗可以用于ASF 的防控。

2 ASF 疫苗誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答

2.1 免疫細(xì)胞B 細(xì)胞和T 細(xì)胞是機(jī)體中最為主要的免疫細(xì)胞，B 細(xì)胞不僅能通過產(chǎn)生抗體來發(fā)揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原遞呈細(xì)胞； T細(xì)胞可介導(dǎo)適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，且在胸腺依賴抗原（TD-Ag）誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的輔助作用。使用表達(dá)ASFV p72 蛋白的重組新城疫病毒免疫小鼠，不僅產(chǎn)生了高滴度的特異性IgG 抗體，還促進(jìn)了T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌（如IFN-γ、IL-4）[34]。而成熟的T 細(xì)胞一般只表達(dá)CD4 或CD8 分子，如CD4+T 淋巴細(xì)胞或CD8+T 淋巴細(xì)胞。CD4 和CD8 分子的主要功能是輔助T 細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別抗原和參與T 細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。ASFV 主要靶向骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，尤其靶向在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的抗原遞呈細(xì)胞（APCs），如單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）等。

DC 可大量表達(dá)MHC-I 和MHC-II 類分子，分泌IL-12 等細(xì)胞因子。感染ASFV 豬的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）可產(chǎn)生高水平的IFN-I，結(jié)果表明漿細(xì)胞樣DC（pDC）可能是豬感染急性ASFV 后產(chǎn)生IFN-I 的來源，另外，一些ASFV 在感染豬的PBMC 中還可以誘導(dǎo)某些B 細(xì)胞激活因子的釋放[35]。

自然殺傷（NK）細(xì)胞可以直接殺死病毒感染的細(xì)胞，還可產(chǎn)生細(xì)胞因子（如IFN）和趨化因子，在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。大多數(shù)IFN 是由NK 細(xì)胞分泌的，而研究證明IFN-γ 和IFN-α 可以抑制體外單核-巨噬細(xì)胞以及一些支持ASFV 復(fù)制的細(xì)胞系中ASFV 的復(fù)制，說明NK 細(xì)胞的活性與ASFV 的致病性之間呈負(fù)相關(guān)[36-37]。

2.2 細(xì)胞因子研究表明，ASF 弱毒疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)與ASFV誘導(dǎo)的細(xì)胞因子有關(guān)。如ASFV弱毒株E75CV1在感染豬1 d后即可有效激活先天性免疫，研究細(xì)胞因子CD163、IL-1β、IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-12 p40（IL-12 的一個(gè)亞基）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體1（TGF-βR1）的表達(dá)水平均顯著上調(diào)；且在感染7 d后，IFN-γ、IL-5、TNF-α、TGF-βR1、IL-21和IL-23的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而防御素β1（DEFB1）、CD163、IL-13和IL-18的表達(dá)水平均顯著下調(diào)；感染ASFV E75CV1 株后幸存豬體內(nèi)的IL-23、IFN-γ 和NF-κB 的表達(dá)水平均上調(diào)，而IL-1β 和IL-4 的表達(dá)水平顯著下調(diào)[21]。以上數(shù)據(jù)表明細(xì)胞因子在抵御ASFV 的感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而具體哪些細(xì)胞因子可以作為評(píng)價(jià)ASF 疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)指標(biāo)尚需進(jìn)一步研究。

IFN 是天然免疫的重要組成部分，在機(jī)體抗病毒方面發(fā)揮重要作用。IFN 誘導(dǎo)的抗病毒分子可以抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和細(xì)胞間的擴(kuò)散，從而抑制病毒在感染細(xì)胞以及周圍非感染細(xì)胞中的復(fù)制[38]。此外，IFN 介導(dǎo)的信號(hào)通路不僅能夠誘導(dǎo)宿主抗病毒蛋白的表達(dá)，還能通過增強(qiáng)MHC 分子的表達(dá)促進(jìn)抗原的遞呈。已有研究表明，豬IFN-I 和IFN-II 可以有效抑制ASFV 的復(fù)制，且將二者高劑量聯(lián)合使用后，該抑制效果更為顯著[37]。雖然細(xì)胞中IFN 的產(chǎn)生受到信號(hào)通路中各因子的層層調(diào)控，但ASFV 已經(jīng)進(jìn)化出多種策略逃逸IFN 的抗病毒反應(yīng)，且能夠作用于IFN 信號(hào)通路的不同靶點(diǎn)進(jìn)而抑制IFN 的分泌、抑制IFN 介導(dǎo)的信號(hào)通路，以及拮抗IFN 誘導(dǎo)的具有抗病毒活性酶的作用等。如ASFV MGF360 家族的A276R 基因通過靶向Toll 樣受體3（TLR3）抑制IFN-β 的產(chǎn)生；TLR3 的同源物I329L 可在Toll 樣受體（TRIF）水平抑制IFN 的分泌等[10]。有研究表明，ASFV 編碼蛋白I226L、A151R、NP419L和QP383R 可以抑制由ASFV 感染而引發(fā)的炎癥反應(yīng)[39]。據(jù)此可以從ASFV 中篩選出能夠抑制IFN 分泌的某個(gè)基因并對(duì)其進(jìn)行敲除，或者開發(fā)能夠促進(jìn)IFN 分泌的疫苗或藥物用于促進(jìn)宿主的IFN 分泌水平，進(jìn)而發(fā)揮其抗病毒作用。

3 ASF 疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答

3.1 ASFV 特異性抗體與免疫保護(hù)在抵御病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用的抗體是體液免疫中的主要效應(yīng)分子，尤其是中和抗體，在清除病毒方面尤為重要，所以探尋誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ASFV 中和抗體的蛋白或表位勢(shì)在必行。雖然早在幾十年前就有報(bào)道制備出了識(shí)別ASFV 主要衣殼蛋白p72 的中和性單克隆抗體（MAb）[40]，不過卻沒有進(jìn)一步的研究。而后就有學(xué)者提出，ASFV 并不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其原因主要在于免疫組織損傷、病毒遺傳變異、抗原競(jìng)爭(zhēng)、免疫抑制、免疫逃避或“木馬”機(jī)制等[41]。不過后來的研究表明ASFV 的p72、CD2v、p12、p54、D117L 和p30 等蛋白均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其中針對(duì)p72 和p30 蛋白的中和抗體可以分別抑制ASFV 的吸附和內(nèi)化，并且均可激活機(jī)體的CTL 應(yīng)答；而機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)膜蛋白CD2v、p12 和D117L 的抗體則可以參與抑制ASFV 的侵入和子代病毒粒子的釋放等。盡管p54、p72 和p30 抗體能夠分別抑制ASFV 的吸附和內(nèi)化，但在豬體內(nèi)存在上述相應(yīng)抗體時(shí)并不能對(duì)其提供一定的免疫保護(hù)，因此，它們并不是典型的中和抗體[17,28]。將重組CD2v 蛋白接種3 次后，再用基因I 型ASFV E75 株攻毒，發(fā)現(xiàn)免疫豬產(chǎn)生了針對(duì)CD2v 蛋白的特異性抗體，雖然免疫豬在攻毒后均能夠存活，但卻存在排毒現(xiàn)象，這表明CD2v 的免疫原性可能并不強(qiáng)，可能需要高劑量才可誘導(dǎo)良好的免疫保護(hù)[42]。也有研究表明，B119L 和DP96R 雙基因缺失的弱毒株可以在免疫后2 周對(duì)豬提供免疫保護(hù)，其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)與野生型病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體有關(guān)，與病毒特異性激活的能夠分泌IFN-γ 的細(xì)胞無關(guān)[22]。這說明雖然傳統(tǒng)滅活疫苗抗ASFV 感染的效果不佳，但其產(chǎn)生的抗體在延遲發(fā)病、降低病毒血癥方面卻有一定的作用。僅誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫卻無法誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的人工修飾的DNA 疫苗（與泛素基因融合表達(dá)的HA、p54 和p30），可對(duì)豬提供33%的免疫保護(hù)[18]。進(jìn)一步研究表明，使用僅激活特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的DNA 疫苗（表達(dá)涵蓋ASFV 基因組的4 000 個(gè)泛素化修飾的質(zhì)粒）免疫豬可獲得60%的免疫保護(hù)[19]。因此， 能否誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生針對(duì)ASFV 的抗體仍是ASF 疫苗免疫保護(hù)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

3.2 ASF 疫苗誘導(dǎo)的CTL 與免疫保護(hù)多項(xiàng)研究表明機(jī)體接種疫苗后產(chǎn)生的特異性細(xì)胞（CD8+T、CD4+T 細(xì)胞）在免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用[18,43-46]。研究發(fā)現(xiàn)豬接種疫苗后可以誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量特異性的CD8+T 淋巴細(xì)胞，而這些特異性淋巴細(xì)胞則可以幫助機(jī)體抵御ASFV 的致死性攻擊；還有研究發(fā)現(xiàn)異源ASFV 的感染同樣可以激活豬體內(nèi)的特異性CD8+T 淋巴細(xì)胞，而且產(chǎn)生的免疫保護(hù)機(jī)制與同源ASFV的類似。例如，使用ASFV低毒力BA7N-ΔCD2v株免疫豬，免疫后再使用異源強(qiáng)毒株E75 OUR T88/1 攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生并激活CD8+T 淋巴細(xì)胞，被激活的CD8+T 淋巴細(xì)胞可以裂解ASFV 感染后的巨噬細(xì)胞，且CD8+T 淋巴細(xì)胞會(huì)隨著ASFV 的減少而減少，直至完全消除ASFV[29,47-48]。這表明CD8+T 淋巴細(xì)胞在殺滅ASFV 時(shí)中起到了關(guān)鍵的作用。反之，將CD8（IgG2a）MAb 注射到已經(jīng)接種過ASFV 弱毒株OUR/T88/3 的豬體內(nèi)，消耗一部分CD8+T 淋巴細(xì)胞后，則會(huì)抑制豬體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，致使豬不能完全抵御ASFV 同源強(qiáng)毒株OUR/T88/1 的致死性攻擊[44]。這進(jìn)一步證明了ASF疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)與其誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，且特異性T 淋巴細(xì)胞的活化是ASF 疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)中極為重要的指標(biāo)。所以說未來疫苗的研究方向應(yīng)該側(cè)重于研發(fā)能夠激活機(jī)體細(xì)胞免疫的相關(guān)疫苗。

由于激發(fā)有效CTL 免疫應(yīng)答的并不是一個(gè)完整抗原分子，而是抗原分子中的一個(gè)或多個(gè)特異性的CTL 表位，所以對(duì)ASFV 保護(hù)性抗原、相關(guān)細(xì)胞表位及其表位多樣性的解析將有助于促進(jìn)ASF 亞單位疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)。自從于ASFV p30 蛋白鑒定到第一個(gè)CTL 表位后，陸續(xù)又從其衣殼蛋白p72 和G1340L鑒定到了CTL 表位。Burmakina 等通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)吸附試驗(yàn)（ELISpot）對(duì)IFN-γ 的分泌水平進(jìn)行測(cè)定，然后又分離免疫ASFV 動(dòng)物的PBMCs，鑒定了存在于CD2v 和C 型凝集素（EP153R）的6 個(gè)離散T 細(xì)胞表位，且分別鑒定了在ASFV 免疫后和感染后這些蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫保護(hù)的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明CD2v 還可以通過刺激特異性CD8+T 淋巴細(xì)胞的增殖來增強(qiáng)其殺滅ASFV 的能力，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[49]。

4 小結(jié)與展望

因ASFV 基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜、免疫逃避機(jī)制多樣、侵入機(jī)制不明確以及缺乏合適的細(xì)胞系等難點(diǎn)，使得對(duì)ASF 的認(rèn)知和防控尤為困難，以至于抗衡ASF 之路艱難而漫長(zhǎng)[50-51]。為了防控ASF，首先要注重加強(qiáng)傳統(tǒng)的防控措施，如實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施、執(zhí)行精準(zhǔn)清除方案以及開展有效的流行病學(xué)調(diào)查等。此外，還要拓展新型養(yǎng)殖模式，如發(fā)展特色新型養(yǎng)殖新模式（實(shí)現(xiàn)機(jī)器自動(dòng)給水送料、設(shè)備自動(dòng)溫控、建立可循環(huán)利用的生態(tài)發(fā)酵床等）。基于目前對(duì)ASFV 的分子免疫學(xué)和疫苗研究現(xiàn)狀，還要加快對(duì)ASFV 毒力相關(guān)基因的免疫原性篩選和功能解析，以此構(gòu)建出更高安全性并且可以誘導(dǎo)持久免疫力的疫苗候選株。目前利用天然分離或敲除毒力相關(guān)基因的ASFV 致弱株制備ASF 弱毒活疫苗是一個(gè)熱點(diǎn)，但要充分評(píng)價(jià)其安全性，比如是否存在不良反應(yīng)、垂直傳播、毒力返強(qiáng)等安全風(fēng)險(xiǎn)。此外，ASF 亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗等基因工程疫苗因其較高的安全性，以及這些疫苗在有效性和鑒別診斷等方面的優(yōu)勢(shì)明顯，所以也可以作為研究方向。但是由于ASFV 基因組龐大以及免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，因此需要充分解析ASFV 主要蛋白的結(jié)構(gòu)功能，篩選保護(hù)性抗原，尋找最佳的ASFV 蛋白組合和免疫遞送策略，例如以感染ASFV存活豬的陽性血清篩選誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV 保護(hù)性抗體的蛋白，以感染ASFV 存活豬的PBMCs 篩選誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV 保護(hù)性細(xì)胞免疫的蛋白，將有效篩選出誘導(dǎo)ASFV 保護(hù)性免疫反應(yīng)的蛋白，繼而開展基因工程疫苗的研究。然而限制ASF 疫苗研究的因素除了ASFV 結(jié)構(gòu)復(fù)雜、編碼蛋白多樣以及不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體外，還有一個(gè)經(jīng)常被忽略的潛在的限制因素一抗體依賴性增強(qiáng)（Antibody-dependent enhancement，ADE）效應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，機(jī)體經(jīng)滅活病毒免疫后，甚至是經(jīng)安全性較高的亞單位疫苗免疫后，均可觀察到臨床癥狀加重的現(xiàn)象[25,52-53]。這表明ADE 效應(yīng)在ASFV 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著一定的作用，該效應(yīng)也可能是現(xiàn)有疫苗不能提供長(zhǎng)期保護(hù)力的一個(gè)原因，因此在今后的研究中需要鑒定出能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ADE 效應(yīng)的ASFV 蛋白并在疫苗研發(fā)過程中避開使用編碼這些蛋白的基因。

總之，ASF 疫苗的創(chuàng)制之路仍任重而道遠(yuǎn)，新的研發(fā)策略如在開發(fā)復(fù)制缺陷型疫苗、mRNA 疫苗以及新型佐劑和新型載體等方面均可嘗試，但無論哪種類型的候選疫苗均需要在保證生物安全的前提下，兼顧其可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，這樣才能加快ASF 疫苗的研發(fā)進(jìn)程，有望研制出安全有效的商品化ASF 疫苗。