A 型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 主要功能的研究進(jìn)展

余樹芳，魏凡華

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

A 型流感病毒（Influenza A virus，IAV）是一種具有包膜的、基因組分節(jié)段的負(fù)鏈RNA 病毒，基因組大小約為14 kb。IAV 基因組由8 個RNA 節(jié)段組成，大小從890 個堿基到2 341 個堿基不等，可編碼最多14 種蛋白：血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）、聚合酶蛋白（PA、PB1 和PB2）、核蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白（M1）、離子通道蛋白（M2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、PA-X 和PB2-F2）[1]。IAV 具有季節(jié)性、地方流行性，是周期性不可預(yù)測的全球大流行流感的罪魁禍?zhǔn)?。在人類歷史上可以追蹤到至少5 次流感病毒大流行，分別是1918 年H1N1 西班牙流感大流行、1957 年H2N2 亞洲流感大流行、1968 年H3N2 香港流感大流行、1977 年H1N1 俄羅斯流感和2009 年H1N1流感大流行[2]。當(dāng)前，2009 年A（H1N1）/pdm2009、H3N2 以及B 型流感病毒是當(dāng)前主要流行的季節(jié)性流感病毒亞型。值得注意的是，多種新型禽流感和豬流感病毒的出現(xiàn)及其在世界范圍內(nèi)的流行，導(dǎo)致人感染禽或豬流感病毒的風(fēng)險增加，加劇了流感病毒的公共衛(wèi)生學(xué)危害[3]。

流感病毒NS1 蛋白是由流感病毒基因組第8 個節(jié)段所編碼，大小為202～237 個氨基酸，分子量約28 ku[4]。流感病毒感染宿主細(xì)胞中的NS1 蛋白是最先表達(dá)的病毒蛋白之一，而且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布具有毒株和亞型特異性[5]。NS1 蛋白盡管在受感染的細(xì)胞中大量產(chǎn)生，但它卻是一種沒有被包裝到病毒顆粒中的病毒蛋白。NS1 蛋白由4 個功能結(jié)構(gòu)域組成：N 末端RNA 結(jié)合域（RBD，aa1～aa73）、連接區(qū)（LR，aa74～aa88）、C 末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（ED，aa85～aa202）和C-末端“尾”（CTT，aa207～aa237）[6]。RBD 中的多種堿性氨基酸（如35R、38R、41K 和46R）對于RNA 結(jié)合活性和抑制雙鏈RNA 依賴性蛋白激酶R（Protein kinase R，PKR）的激活是至關(guān)重要的[7]。ED通過靶向多種宿主因子可以抑制抗病毒反應(yīng)以及促進(jìn)病毒復(fù)制，如PKR、裂解及腺苷酸化特異因子30（Cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF30）和磷脂酰肌醇-3 激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的調(diào)節(jié)性亞基P85β。ED 結(jié)構(gòu)域的W187殘基介導(dǎo)了NS1 蛋白二聚體的形成，W187R 突變減少了NS1 蛋白二聚體的形成，導(dǎo)致病毒毒力的下降[8]。此外，E186、D189和V194殘基在NS1 與CPSF30 的結(jié)合中起著重要作用，這些位點的氨基酸變異削弱了NS1 與CPSF30 的結(jié)合，導(dǎo)致NS1 蛋白的宿主基因關(guān)閉功能受損[9]。大量的研究已經(jīng)證明，NS1 蛋白功能的發(fā)揮依賴于它參與的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用的能力[10]。截至目前，已經(jīng)鑒定出了20多個與NS1蛋白發(fā)生相互作用的宿主因子（表1）[10]?？傮w而言，NS1 蛋白作為一種具有多效性的蛋白質(zhì)能與多種宿主因子相互作用并通過干擾宿主細(xì)胞正常的抗病毒反應(yīng)，最終促進(jìn)病毒自身的感染和復(fù)制。本文主要從以下三個方面綜述NS1 蛋白生物學(xué)功能的研究進(jìn)展：（I）拮抗宿主的抗病毒天然免疫應(yīng)答；（II）參與細(xì)胞自噬過程；（III）介導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡。

表1 與NS1蛋白相互作用的宿主蛋白

1 NS1 蛋白拮抗宿主的抗病毒天然免疫應(yīng)答

1.1 NS1 蛋白調(diào)控IFN-I 信號通路的關(guān)鍵信號分子IAV 感染會觸發(fā)宿主的天然免疫反應(yīng)，這是宿主防御的第一道防線。天然免疫系統(tǒng)使用不同的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）[包括Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）和維甲酸誘導(dǎo)基因I 樣受體（RIG-I-like receptor，RLR）等]來識別侵入的病毒成分。病毒RNA 與PRR 的結(jié)合誘導(dǎo)了RIG-I 的構(gòu)象變化以及K63 連接的RIG-I 的泛素化和寡聚化[11]。寡聚化的RIG-I 與線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致MAVS 的寡聚并募集TBK1 和IKKα/β。隨后，TBK1 使干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factors，IRFs）磷酸化從而導(dǎo)致IRFs 的核轉(zhuǎn)位。同時，IKK 介導(dǎo)IκB 的磷酸化和降解能夠?qū)е翹F-κB的釋放。IRFs 和NF-κB 形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活I(lǐng) 型干擾素（IFN-I）的表達(dá)（圖1）。

圖1 流感病毒激活I(lǐng)型干擾素的示意圖

IAV 感染會導(dǎo)致IFN-I 表達(dá)上調(diào)。IFN-I 能與受感染細(xì)胞或鄰近細(xì)胞中的IFN-α/β 受體結(jié)合，以自分泌、旁分泌等刺激抗病毒反應(yīng)。IFN-I 與受體的相互作用導(dǎo)致Janus 家族蛋白激酶（JAKs）Tyk2 和Jak1 的磷酸化和激活，導(dǎo)致信號分子的募集和激活[如信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子1（Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和STAT2][12]。激活后，STAT1 和STAT2 與IRF9 形成IFN 刺激基因因子3（Interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3），ISGF3 移位到細(xì)胞核中可誘導(dǎo)干擾素刺激基因（Interferon stimulated genes，ISGs）的表達(dá)[12]。ISGs 產(chǎn)物[如粘病毒抗性蛋白（Myxovirus resistance，Mx）、干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（Interferon-induced transmembrane proteins，IFITM）、蛋白激酶R（PKR）和2'-5'合成酶（2'-5'-oligoadenylate synthetase，OAS/RNAse L）等]可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)，這在一定程度上減少了病毒從最初感染部位的繼續(xù)傳播。

NS1 蛋白在感染早期主要定位于細(xì)胞核，隨后輸出到細(xì)胞質(zhì)，是流感病毒編碼的最重要的干擾素拮抗蛋白。NS1 蛋白是一種多功能毒力因子，能夠與IFN-I 通路中的不同組分相互作用從而抑制宿主抗病毒應(yīng)答反應(yīng)[13]。NS1 蛋白通過其位于前73 個氨基酸末端的RNA 結(jié)合域與病毒RNA 結(jié)合進(jìn)而阻止其被TLRs 和視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）識別。此外，NS1 蛋白能與宿主細(xì)胞蛋白（RIG-I、PKR 和OAS 等）競爭性結(jié)合病毒RNA并降低其活性。例如，NS1通過與dsRNA 結(jié)合來抑制OAS 的激活[14]；NS1 還可以通過結(jié)合和抑制TRIM25的活性來抑制RIG-I的激活。

RIG-I 能夠識別并結(jié)合流感病毒RNA 中的特定結(jié)構(gòu)/序列（例如雙鏈區(qū)的5'三磷酸末端）引發(fā)其構(gòu)象變化，暴露其N-端CARD 結(jié)構(gòu)域[15]。暴露的CARD域通過E3 連接酶（如TRIM25 和Riplet）的泛素化作用來激活CARD 結(jié)構(gòu)域，這一過程導(dǎo)致RIG-I 與MAVS的相互作用并激活了IFN-I 的轉(zhuǎn)錄。NS1 蛋白可以與TRIM25 結(jié)合，從而抑制RIG-I CARD 結(jié)構(gòu)域和IRF3 的激活。也有研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒NS1 蛋白結(jié)合TRIM25 和Riplet 泛素E3 連接酶以抑制RIG-I 泛素化和IFN-I 的產(chǎn)生過程具有宿主特異性[15]。NS1 蛋白還可以誘導(dǎo)去泛素酶OTUB1 的蛋白酶體降解，通過抑制K48 多泛素水解和與UBCH5c 形成E2 抑制復(fù)合物的雙重機制拮抗RIG-I 抗病毒反應(yīng)[16]。此外，NS1蛋白通過與p85β 亞基相互作用激活PI3K 通路來增強IRF3的活性從而增加IFN-I和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。NS1蛋白還可以通過靶向IKKβ來抑制NF-κB通路的激活以及在細(xì)胞核內(nèi)削弱IKK 對組蛋白3（H3）的磷酸化，進(jìn)而阻止抗病毒基因的表達(dá)[18]。

1.2 NS1 蛋白抑制IFN-I 前體mRNA（pre-mRNA）的加工過程除了抑制天然免疫信號通路外，NS1還通過阻斷宿主的mRNA 翻譯（例如IFN-I 和ISGs等）抑制宿主基因的表達(dá)。NS1 蛋白通過結(jié)合兩種細(xì)胞蛋白：CPSF30 和聚腺苷酸結(jié)合蛋白II（PABII），提供了阻斷3'末端細(xì)胞或病毒前體mRNAs 加工的關(guān)鍵功能。由于NS1 蛋白對CPSF30 的隔離，未加工的細(xì)胞前體mRNAs 積累在細(xì)胞核中，致細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞mRNA 的產(chǎn)生受到抑制[19]。研究發(fā)現(xiàn)，不同病毒株結(jié)合CPSF30 的能力是不同的。H3N2 和H2N2 病毒的NS1 蛋白能夠有效結(jié)合CPSF30 并抑制IFN-I 基因pre-mRNA 的加工，然而，H1N1亞型PR8病毒的NS1不能與CPSF30相互作用，而且H5N1病毒NS1蛋白的L103F和I106N突變增加了NS1與CPSF30的相互作用，從而增強了H5N1病毒的致病性[20]。此外，NS1蛋白可以與真核翻譯起始因子eIF4B 相互作用，參與宿主基因mRNA的翻譯起始。例如，NS1誘導(dǎo)eIF4B蛋白的降解導(dǎo)致了IFN 誘導(dǎo)的跨膜蛋白3（Interferon-induced transmembrane protein 3，IFITM3）的表達(dá)減少，進(jìn)而增加流感病毒的復(fù)制水平[19]。總之，NS1 蛋白對宿主基因表達(dá)的廣泛抑制，不僅抑制了IFN-I 的高效表達(dá)也阻止了其他抗病毒基因的表達(dá)。

1.3 NS1 蛋白調(diào)控炎性小體引發(fā)的炎性反應(yīng)流感病毒感染可激活NLRP3 炎性小體并產(chǎn)生IL-1β，進(jìn)而促進(jìn)宿主的天然免疫反應(yīng)。NLRP3的激活會形成一種由寡聚NLRP3、ASC 和Caspase-1 組成的細(xì)胞溶質(zhì)多蛋白復(fù)合物。Toll 樣受體或RIG-I 樣受體識別病毒RNA，導(dǎo)致pro-IL-1β 和NLRP3 的表達(dá)[21]。當(dāng)NLRP3炎性小體被激活時，會引起ASC 復(fù)合物的形成和Caspase-1的激活，導(dǎo)致IL-1β的成熟。

研究發(fā)現(xiàn)，NS1 蛋白與NLRP3 的相互作用可以抑制小鼠巨噬細(xì)胞系和人THP-1細(xì)胞中炎性小體的活化，降低IL-1β的產(chǎn)生[22]。Park等發(fā)現(xiàn)攜帶NS1 C末端缺失的pH1N1/09病毒比野生型病毒誘導(dǎo)的IL-1β水平顯著升高，而且僅C 端aa100～aa219 的表達(dá)就可以導(dǎo)致IL-1β 的分泌水平降低，這表明NS1 蛋白的C 末端對炎性小體的激活具有抑制作用[22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NS1 蛋白的RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（堿性殘基aa38和aa41）和TRIM25 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（酸性殘基aa96 和aa97）是抑制NLRP3 炎性小體激活所必需的。因此，NS1 蛋白具有抑制NLRP3 炎性小體激活的功能，有助于病毒逃逸宿主的免疫防御。值得注意的是，流感病毒的其他病毒蛋白也可調(diào)節(jié)NLRP3 炎性小體的激活。例如M2 蛋白和PB1-F2 蛋白均能刺激氧化的DNA 釋放從而觸發(fā)NLRP3 炎性小體的激活，但是這些病毒蛋白觸發(fā)NLRP3 炎性小體激活的確切機制仍不清楚[21]。因此更好地了解病毒蛋白在調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng)和流感病毒感染發(fā)病機制中的作用，將有助于開發(fā)更為有效的干預(yù)措施來治療與流感病毒相關(guān)的疾病。

2 NS1 蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞凋亡，或稱程序性細(xì)胞死亡，是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程。細(xì)胞凋亡主要通過外在凋亡通路（線粒體凋亡通路）和內(nèi)在凋亡通路（死亡受體凋亡通路）來激活。細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞抵御流感病毒感染的一種防御機制，能夠抑制病毒的復(fù)制和傳播[23]。然而，為了更好的促進(jìn)病毒復(fù)制，流感病毒也進(jìn)化出多種策略來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的凋亡過程。

多項研究表明流感病毒感染可誘導(dǎo)多種宿主細(xì)胞的凋亡。流感病毒在感染初期主要通過上調(diào)抗凋亡的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）途徑抑制細(xì)胞凋亡，在感染后期則通過抑制PI3KAKT 途徑以及上調(diào)促凋亡的p53 途徑進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[24]。研究表明來自不同流感病毒株的病毒蛋白調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的凋亡過程不同，有的具有促凋亡作用，有的則發(fā)揮抗凋亡功能。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 在流感病毒感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮雙重功能。早期研究表明，流感病毒NS1 蛋白可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡過程，而缺失NS1 基因的重組流感病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的能力強于野生型病毒[24]。NS1 蛋白抑制宿主細(xì)胞凋亡的原因可能與NS1 抑制IFN-I 的產(chǎn)生有關(guān)，因為IFN-I 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，NS1 蛋白也可以與PI3K 的P85β 調(diào)節(jié)亞型的SH2結(jié)構(gòu)域或者Crk 或CrkL 的N 末端SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活PI3K/Akt 通路從而延遲流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，這為病毒復(fù)制提供足夠的時間[24]。NS1 蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的能力也依賴于流感病毒其他病毒蛋白或宿主因子的參與。例如，宿主因子p53 在介導(dǎo)流感病毒感染引發(fā)的細(xì)胞凋亡中起著重要作用，NS1 能夠與p53結(jié)合并抑制p53 介導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡過程，這表明p53 是流感病毒靶向調(diào)控感染宿主細(xì)胞凋亡的分子之一。綜上所述，NS1 蛋白在細(xì)胞凋亡中起重要作用，因此靶向定位病毒生命周期不同階段的NS1 蛋白為治療IAV 的感染提供了新思路。

3 NS1 蛋白影響細(xì)胞自噬

自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)溶酶體依賴的自我消化過程。多種信號參與自噬的誘導(dǎo)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和免疫信號激活。自噬是消除侵入病原體免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器，并且也參與了病原體侵入的免疫識別。自噬過程可分為兩個階段：自噬體形成的初始階段和自噬小體與溶酶體的融合并降解自噬體內(nèi)容物的終末效應(yīng)階段（成熟）。其中磷脂酰肌醇-3-激酶III 類（Phosphatidylinositol-3-kinase class III，PI3K-III）、Beclin（Atg6）和LC3（Atg8）是參與自噬的重要因子[25]。

IAV 感染可誘導(dǎo)多種哺乳動物細(xì)胞系中自噬體的積聚（如感染IAV 可誘導(dǎo)自噬體在小鼠和人肺組織中的積聚），這說明自噬參與了流感病毒的復(fù)制過程。然而，自噬在IAV 復(fù)制過程中所起的作用是有爭議的，這與細(xì)胞類型和病毒株有關(guān)[26]。另外，自噬也是宿主細(xì)胞抑制流感病毒復(fù)制的重要天然免疫機制。流感病毒感染可以誘導(dǎo)自噬體形成，反之誘導(dǎo)流感病毒感染細(xì)胞中自噬體的降解過程有助于限制病毒復(fù)制。這是由于阻止自噬體的降解過程將導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)自噬體和LC3-II 的積聚以及病毒蛋白抗原識別的逃逸[27]。目前認(rèn)為，流感病毒的M2、NP、HA 和NS1 蛋白參與了自噬過程。流感病毒的NP 和M2 蛋白均可通過AKT-mTOR 信號通路誘導(dǎo)自噬[26]。H5 和H7 亞型流感病毒HA 蛋白的切割產(chǎn)物可以上調(diào)LC3-II 蛋白的水平，說明HA 蛋白可以激活自噬過程[25]。研究發(fā)現(xiàn)，NS1 也可以誘導(dǎo)自噬過程，這主要依賴于增加M2 和HA 的合成，從而間接地誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬過程[25]。

不同亞型流感病毒對自噬具有不同的影響，例如H5N1 亞型流感病毒可以誘導(dǎo)完全和功能性自噬，而H9N2 和H1N1 病毒不能誘導(dǎo)功能性自噬。研究發(fā)現(xiàn)，H5N1 病毒通過抑制mTOR 信號通路來抑制細(xì)胞的自噬過程，這一過程依賴于腫瘤抑制蛋白2（Tumor suppressor protein 2，TSC2）的調(diào)節(jié)表達(dá)[28]?？傊?，更好地了解IAV 對自噬的調(diào)節(jié)過程以及參與自噬調(diào)節(jié)的各種病毒蛋白的作用，對開發(fā)新的抗病毒藥物具有重要的理論意義。例如，PI3K 參與自噬膜的形成，而PI3K 抑制劑可以明顯降低流感病毒感染早期的病毒滴度和蛋白合成[29]。

4 小結(jié)與展望

流感病毒是具有強傳染性的人畜共患病的病原，每年造成人和動物的大量死亡，嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全。禽流感和豬流感的出現(xiàn)，對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。當(dāng)流感病毒感染宿主呼吸道細(xì)胞時，NS1 對宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的抑制作用決定了病毒的致病性。為了進(jìn)一步解析NS1 蛋白在流感病毒感染中的功能，將來的研究方向應(yīng)著眼于通過多種分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)方法解析NS1 在抑制宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中的詳細(xì)機制，同時研究NS1 蛋白的其他生物學(xué)功能，從而為流感的防控提供一定的理論基礎(chǔ)。