CP 和NCP 型牛病毒性腹瀉病毒腹腔注射小鼠感染模型的建立

吳陳華，王麗娜，岳 山，陳楠楠，黃雯靜，高 麗，付金蕾，劉思雨，趙 童，白彤彤，蘇思雨，黃 江，白彪慧，金 鑫，范春玲,2，劉 宇,2，張澤財(cái),2，周玉龍,2，朱戰(zhàn)波,2*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 大慶 163319）

牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙VD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起牛的一種接觸性傳染病。BVDV 是黃病毒科（Flaviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，該病毒屬還包括豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病毒?。˙order disease virus，BDV）[1]。根據(jù)是否引起細(xì)胞病變，BVDV 可分為兩種生物型：致細(xì)胞病變型（Cytopathogenic，CP）和非致細(xì)胞病變型（Noncytopathogenic，NCP）[2]；根據(jù)BVDV 基因序列的差異，BVDV 又可分為BVDV-1、BVDV-2 和BVDV-3 3 個(gè)基因型。由于BVDV易突變且不同的病毒株間存在同源重組現(xiàn)象，因此BVDV基因亞型眾多，目前BVDV-1分為1a～1u共21個(gè)亞型，BVDV-2分為2a～2d共4個(gè)亞型[3]。

BVDV 的天然宿主包括牛、羊、豬和多種反芻動(dòng)物，反芻動(dòng)物價(jià)格高，不宜作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此小鼠用于BVDV 的研究更具優(yōu)勢(shì)。構(gòu)建穩(wěn)定的小鼠感染模型有助于研究BVDV 體內(nèi)感染的致病機(jī)理及疫苗開發(fā)。研究顯示，BVDV 急性感染后主要表現(xiàn)為白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板減少等癥狀[4-5]。對(duì)妊娠母羊和胚胎人工感染BVDV，母羊及感染后所生的羔羊均產(chǎn)生了明顯的臨床癥狀，剖檢可見消化道粘膜彌散性出血、腸系膜淋巴結(jié)腫大等病理變化[6]。Bachofen 等通過(guò)耳緣靜脈注射、滴鼻和采食被BVDV 污染的干草等3 種接種方式感染兔子，結(jié)果顯示BVDV 在回腸中的病毒載量最高，且淋巴組織表現(xiàn)出現(xiàn)了典型的病理變化[7]。Han等通過(guò)口服低劑量和高劑量的NCP型BVDV感染BALB/c 小鼠，結(jié)果顯示，NCP 型BVDV 感染的BALB/c 小鼠體內(nèi)的血小板降低，且高劑量感染的BALB/c 小鼠的淋巴細(xì)胞減少[8]。Seong 等通過(guò)腹腔注射和滴鼻兩種感染方式對(duì)BALB/c 小鼠接種了3 株BVDV。結(jié)果顯示，腹腔注射比滴鼻的感染方式成功率更高[9]。上述研究表明小鼠可以感染BVDV 并出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，有望作為BVDV 感染的動(dòng)物模型，但不同生物型BVDV感染小鼠的致病性差異尚不清楚。

目前，關(guān)于BVDV 感染小鼠的致病性和動(dòng)物感染模型的研究較少。為了建立CP 和NCP 型BVDV 急性感染的小鼠模型。本研究利用腹腔注射BVDV 的方式感染BALB/c 小鼠，研究感染小鼠體內(nèi)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板和BVDV 抗原在各組織中的增殖情況，比較兩種不同生物型BVDV 在小鼠血液和組織中的分布差異及病理變化，為BVDV 疫苗的研制和致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料CP 型BVDV NADL 株及NCP 型BVDV NY-1 株、4%多聚甲醛、牛腎上皮細(xì)胞（MDBK）由本實(shí)驗(yàn)室保存。BVDV NPro多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；SP Kit（Broad Spectrum）（SP-0022）購(gòu)自博奧森公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；TRIzol 購(gòu)自Invitrogen 公司；蘇木精-伊紅染色液購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PremixTaqII 購(gòu)自TaKaRa 公司。SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠（18 g～22 g）購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.2 小鼠的感染試驗(yàn)將BALB/c 小鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌條件的動(dòng)物房?jī)?nèi)，適應(yīng)7 d 消除應(yīng)激后隨機(jī)分為3組，分別為CP 組、NCP 組和對(duì)照組，每組各9 只。參照Seong 的方法將CP 組和NCP 組小鼠每只經(jīng)腹腔注射0.4 mL 104TCID50/mL 相應(yīng)病毒液[9]，對(duì)照組每只注射0.4 mL DMEM。每天觀察記錄小鼠的臨床癥狀，對(duì)死亡小鼠及時(shí)剖檢并觀察其剖檢部位的病變情況，共觀察10 d。

1.3 病料采集及小鼠血常規(guī)的檢測(cè)分別于感染后第4 d、7 d 和10 d 每組各隨即選擇3 只小鼠，通過(guò)眼眶采集EDTA 抗凝血，使用全動(dòng)物血細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)各組小鼠的血常規(guī)，主要包括檢測(cè)其白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）及血小板（PLT）數(shù)量，迫殺上述每組感染后7 d 的各3 只小鼠，觀察其剖檢病變。然后，采集各組小鼠糞便及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、結(jié)腸、回腸、空腸、十二指腸等臟器。各臟器一份用于提取核酸檢測(cè)病毒載量，另一份用4%多聚甲醛溶液固定，用于免疫組化和組織病理檢查。

1.4 BVDV載量的熒光定量PCR檢測(cè)將各組小鼠糞便用生理鹽水稀釋后離心取上清：各組織樣品經(jīng)研磨、反復(fù)凍融后，3 000 r/min 離心10 min，取上清采用TRIzol 法提取血液、糞便及各臟器組織懸液中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后作為模板，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量PCR 方法檢測(cè)各樣品中的BVDV 載量[10]。上游引物：5'-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3'/下游引物：5'-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3'。反應(yīng)程序：94 ℃2 min，94 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃5 min，40 個(gè)循環(huán)。

1.5 小鼠各組織免疫組化及組織病理學(xué)檢查將各組小鼠各組織樣品經(jīng)4%甲醛中固定、酒精脫水、石蠟包埋、制備組織切片。以NPro多克隆抗體（1∶600）為一抗孵育過(guò)夜。以SP-022 生物素標(biāo)記的山羊抗兔、大鼠、小鼠和豚鼠IgG 廣譜抗體為二抗孵育1 h。經(jīng)免疫組化檢測(cè)各組織中的BVDV 抗原的分布；將另一部分各組織切片經(jīng)蘇木精/伊紅染色（HE）后，經(jīng)顯微鏡觀察各組織（脾臟、肝臟和腸）的病理變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次獲得相應(yīng)的結(jié)果后采用GraphPad Prism 6.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖及分析，并采用SPSS 19.0 對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 感染后小鼠的臨床癥狀以及剖檢病理變化分別通過(guò)腹腔注射感染CP 型和NCP 型BVDV 后，大部分小鼠均表現(xiàn)出一定的臨床癥狀。主要表現(xiàn)為被毛粗糙、聚堆、精神沉郁、采食減少等。對(duì)照組小鼠無(wú)明顯的臨床癥狀。分別將CP 和NCP 型BVDV 感染后第7 d 的小鼠剖檢均可見肺和肝有出血點(diǎn)，脾腫大，腸道內(nèi)容物呈黃色水樣狀，對(duì)照組小鼠無(wú)明顯的病理變化。結(jié)果表明兩種生物型的BVDV 感染后均造成了小鼠一定的臨床癥狀及剖檢病變。

2.2 小鼠的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果小鼠腹腔注射兩種生物型BVDV 后的第4 d、7 d、10 d 采血進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定，結(jié)果顯示，感染后的不同時(shí)間，CP 組和NCP 組小鼠血液中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的數(shù)量均低于對(duì)照組。感染后第7 d，CP 組與NCP 組小鼠血液中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)量與對(duì)照組相比差異均極顯著（P＜0.001）；感染后第10 d，CP 組小鼠血液中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)量與對(duì)照組相比差異均極顯著（P＜0.01），NCP 組小鼠血小板數(shù)量與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），淋巴細(xì)胞數(shù)量差異顯著（P＜0.05），白細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。且感染后第7 d 和第10 d CP 組小鼠的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的數(shù)量均低于NCP 組（圖1），結(jié)果表明小鼠出現(xiàn)了BVDV 急性感染后的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板減少等癥狀，且CP 型BVDV 比NCP型BVDV 對(duì)小鼠的致病性更強(qiáng)。

圖1 感染BVDV后小鼠體內(nèi)白細(xì)胞（A）、淋巴細(xì)胞（B）及血小板數(shù)量（C）的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination of leukocytes(A),lymphocytes(B)and platelets(C)in mice infected with BVDV

2.3 小鼠BVDV 載量的熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果小鼠腹腔注射不同生物型BVDV后的第4 d、7 d、10 d采集其各組織樣品、糞便和血液樣品，進(jìn)行病毒載量的檢測(cè)。結(jié)果顯示：感染后第4 d CP組小鼠除了空腸以外的其他組織均能檢測(cè)到病毒，NCP組小鼠除了結(jié)腸以外的其他組織均能檢測(cè)到病毒（圖2A）；感染后第7 d CP 組和NCP 組小鼠的各組織中均能檢測(cè)到病毒（圖2B）；感染后第10 d CP 組小鼠除了肝臟、十二指腸和結(jié)腸以外的其他組織均能檢測(cè)到病毒，NCP組小鼠除了肺臟以外的其他組織均能檢測(cè)到病毒（圖2C）。病毒載量結(jié)果顯示，感染后第7 d 小鼠大部分組織中的病毒載量高于感染后第4 d 和第10 d 小鼠組織中的病毒載量，兩種生物型BVDV 感染小鼠后不同時(shí)間血液中的病毒載量均較高。對(duì)照組小鼠各組織均未檢測(cè)到相應(yīng)病毒（圖2）。表明小鼠在感染BVDV 后第7 d的病毒載量最高，且血液和脾臟最適用于BVDV的檢測(cè)。

圖2 BVDV載量的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The BVDV viral load detected by real-time fluorescence quantitative PCR

2.4 小鼠各組織的免疫組化結(jié)果對(duì)BVDV感染后第7 d小鼠的各組織進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示，CP組：十二指腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞（圖3A）、肝細(xì)胞（圖3D）、脾臟淋巴細(xì)胞中均呈BVDV陽(yáng)性（圖3G）。NCP 組：十二指腸黏膜上皮細(xì)胞、腸腺上皮細(xì)胞（圖3B）、肝臟中的巨噬細(xì)胞（圖3E）、脾臟淋巴細(xì)胞均呈BVDV陽(yáng)性（圖3H）。對(duì)照組小鼠各組織則均為陰性結(jié)果（圖3C、圖3F、圖3I）。感染后第7dCP組和NCP組小鼠各組織中均檢測(cè)到了BVDV 抗原，均呈陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果表明CP型和NCP型BVDV均能侵染小鼠各組織。

圖3 小鼠各組織的免疫組化結(jié)果（400×）Fig.3 Immunohistochemical results of various organs in mice

2.5 小鼠各組織病理變化的觀察結(jié)果通過(guò)顯微鏡觀察各組小鼠感染后第7 d 的組織病理切片，結(jié)果可見CP 組小鼠十二指腸腸腺上皮變性壞死脫落、間質(zhì)疏松水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4A），肝細(xì)胞腫脹、空泡變性和壞死（圖4D），脾臟間質(zhì)疏松水腫（圖4G）；NCP組小鼠十二指腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落（圖4B），肝臟肝血竇可見淋巴細(xì)胞炎性浸潤(rùn)（圖4E），脾臟淋巴細(xì)胞可見變性和壞死（圖4H）。對(duì)照組小鼠各組織均無(wú)明顯病理變化（圖4C、圖4F、圖4I）。結(jié)果表明，兩種生物型BVDV 感染后均可致小鼠組織的病理?yè)p傷，CP組小鼠組織損傷較NCP組小鼠嚴(yán)重，同時(shí)表明本研究建立了CP 和NCP BVDV 小鼠的急性感染模型。

圖4 小鼠各組織的病理變化（HE染色，400×）Fig.4 Histopathological changes in different tissues in mice(HE staining)

3 討 論

BVDV 能夠致牛的呼吸系統(tǒng)發(fā)病、并能致其腹瀉和生殖障礙，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。有研究表明BVDV 接種妊娠母羊和胚胎后，產(chǎn)生了明顯的臨床癥狀[7]。有研究結(jié)果表明，新西蘭兔食用了被BVDV 污染的干草后，在其大多數(shù)器官檢測(cè)到了BVDV，且組織淋巴出現(xiàn)了典型病變[6]。與兔和羊作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比較，小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更有利于BVDV 的研究。有研究表明將BVDV 以腹腔注射的方式感染BALB/c 小鼠建立感染模型的成功率更高[9]。所以本研究采用該方式感染BALB/c 小鼠。

本研究將CP 型BVDV NADL 株和NCP 型NY-1株分別通過(guò)腹腔注射感染BALB/c 小鼠后，大部分小鼠出現(xiàn)了背毛粗糙、扎堆、精神萎靡等臨床癥狀，但在本研究中兩組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉的臨床癥狀。在感染后7 d 剖檢兩組感染小鼠可觀察到其肝臟、心臟和肺臟均有出血點(diǎn)，脾腫大，且病理切片結(jié)果顯示感染后7 d 兩組感染小鼠的十二指腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落。表明感染后的小鼠雖然未出現(xiàn)腹瀉的臨床癥狀，但在腸道和各臟器中均出現(xiàn)了病理變化，初步證明BVDV 能夠感染BALB/c 小鼠，且能致其組織出現(xiàn)相應(yīng)病變。

有研究顯示，BVDV 急性感染犢牛后白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的數(shù)量均降低[5]；BVDV 急性感染BALB/c 小鼠后出現(xiàn)了白細(xì)胞降低及淋巴細(xì)胞減少的癥狀[8]，與本研究的結(jié)果相似。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在感染后第4 d、7 d 和10 d，CP組和NCP 組小鼠血液中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板數(shù)量均降低。感染后第7 d 和10 d CP 組小鼠的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的數(shù)量均比NCP 組的低，由此推測(cè)CP 型BVDV 比NCP 型BVDV 對(duì)小鼠的致病性更強(qiáng)。

本研究利用熒光定量PCR 方法檢測(cè)感染組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和空腸等組織以及糞便和血液中的BVDV 載量。結(jié)果顯示，在感染后第7 d CP 組和NCP 組的各組織、糞便和血液中均能檢測(cè)到病毒，且在小鼠血液中的BVDV 載量最高。有研究將CP 型BVDV 通過(guò)腹腔注射的方式感染小鼠，在感染組的肺臟和肝臟中BVDV 的檢出率最高[12]，這與本研究結(jié)果有差異。推測(cè)這一差異可能是病毒株和感染的病毒量不同所致。

Seong 等通過(guò)腹腔注射的方式將BVDV-1 感染BALB/c 小鼠，免疫組化結(jié)果顯示，在感染后第7 d小鼠的肺臟、脾臟和腸等臟器中均檢測(cè)到了BVDV抗原[13]。本研究中感染后第7 d 小鼠的脾臟、肝臟和腸均能檢測(cè)到BVDV 抗原。與上述研究結(jié)果相符。本研究中感染組小鼠組織的病理切片觀察可見十二指腸腸腺上皮變性、壞死、脫落、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腸黏膜壞死、脫落，肝細(xì)胞壞死、肝血竇淋巴細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，脾臟淋巴細(xì)胞可見變性和壞死等病理變化。且CP 組小鼠組織病變較NCP 組小鼠嚴(yán)重。Seong 等通過(guò)腹腔注射和滴鼻的方式將NCP 型BVDV-1 感染BALB/c 小鼠，組織病理切片觀察結(jié)果顯示，兩種感染方式感染小鼠的肝臟均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞增多等病理變化[9]。以上研究結(jié)果均表明，CP 和NCP 型BVDV 感染BALB/c 小鼠后均可在其各組織中檢測(cè)到BVDV 抗原，且均能致其組織出現(xiàn)一定的病理?yè)p傷。

本研究通過(guò)腹腔注射的方式將CP 型和NCP 型BVDV 感染BALB/c 小鼠。根據(jù)臨床癥狀和病理變化，血常規(guī)、病毒載量及抗原組織分布、免疫組化等結(jié)果表明，建立了兩種不同生物型BVDV 急性感染的小鼠模型。為進(jìn)一步對(duì)BVDV 的疫苗研制和致病機(jī)理等研究奠定了基礎(chǔ)。