potA 基因缺失對豬鏈球菌2 型生物學(xué)特性及致病性影響的研究

劉萬全，鄭立紅*，劉 丹，梅慶步，張明龍，張春艷

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播的革蘭氏陽性人獸共患病原菌。其中豬鏈球菌2 型（SS2）致病性最強，在全世界流行最廣[1]，能夠引起豬和人的致命性感染，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅人類健康。SS2能夠致人的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、中毒性休克綜合征和嚴重的后遺癥甚至死亡，包括中國在內(nèi)的東南亞是人、豬感染的重災(zāi)區(qū)。1998年和2005年該菌的感染在我國的兩次大暴發(fā)造成了52人的感染死亡，成為世界高度關(guān)注的人獸共患病原菌之一[2-3]。

細菌中的多胺參與許多生理過程，如微生物的致癌作用、細菌素的產(chǎn)生、逃逸吞噬溶酶體的吞噬作用、生物被膜的形成和細菌的毒性作用等。在肺炎鏈球菌和大腸桿菌等病原菌中，多胺的合成和轉(zhuǎn)運對病原菌的環(huán)境適應(yīng)性和致病性均起重要作用，其相關(guān)基因的缺失均能夠有效影響該病原菌對小鼠的致病能力[4-5]。多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)PotABCD 廣泛存在于各類細菌中，其中PotD 是外源多胺的胞外結(jié)合蛋白，PotA 是與膜相關(guān)的胞內(nèi)ATP 酶。而其他蛋白質(zhì)包括：PotB 和PotC 構(gòu)成了多胺轉(zhuǎn)運的跨膜通道。PotD 結(jié)合胞外多胺會促使其構(gòu)象改變，形成更加緊密的蛋白結(jié)構(gòu)，進而誘發(fā)PotBC 通道的構(gòu)象改變。PotA 在水解ATP 后能夠?qū)⑼庠炊喟窋z入到胞內(nèi)。

本研究室前期研究證實，SS2 和其他革蘭氏陽性菌一樣，只含有PotABCD 一個多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，并證明了SS2 轉(zhuǎn)運多胺的偏好依次為亞精胺、精胺和腐胺[6]。PotA 蛋白具有ATP 酶水解活性，能夠水解ATP 為外源多胺的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運提供能量。本研究利用同源重組方法構(gòu)建SS2potA基因缺失突變株，通過表型觀察、生長速率測定、SS2 感染后小鼠存活率及組織定植和粘附侵入細胞等試驗進一步探究potA基因缺失對SS2 致病能力的影響，旨在為闡明SS2的生長和致病性的調(diào)控機制及抗該菌感染藥物靶點的探尋奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料SS2 SC-19 株于2005 年分離自SS2 感染的病豬；大腸桿菌DH5α 購自Trans 公司；大腸桿菌-豬鏈球菌穿梭質(zhì)粒pSET4S 由日本學(xué)者Daisuke Takamatsu 惠贈，用于SS2 菌株基因的定點敲除[7-8]；4周齡～6周齡雌性昆明SPF小鼠，體重18（±2）g，購自武漢生物制品所；TSA 和TSB 培養(yǎng)基購自Difco公司；新生牛血清購自杭州四季青有限公司；壯觀霉素（Spc）購自Biosharp 公司；鼠源PotA 蛋白多克隆抗體為本研究室自制；羊抗鼠IgG（H+L）購自Abcam公司；RNA 提取試劑RNAiso plus、高保真PCR 聚合酶PrimeStar、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶及buffer 均購自TaKaRa 公司；細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒與PCR 及酶切產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細菌總蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HiScriptTMReverse Transcriptase 試劑盒和AceQTMqRCR 試劑盒購自Vazyme 公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成本實驗所有引物均參照SC-19 菌株的基因組（2005 年分離自四川省資陽市，NZ_CP020863.1）設(shè)計，包括：pSET4S-P 重組質(zhì)粒構(gòu)建引物、potA基因鑒定引物和qRT-PCR 檢測引物（表1），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 本研究所用的引物Table Primers used in this study

1.3 potA基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定以提取的SC-19 菌株的基因組為模板，采用引物PotAup-F/R和PotAdown-F/R 分別經(jīng)PCR 擴增potA基因的上下游同源臂，以SphI 和SalI 雙酶切上游同源臂的PCR 產(chǎn)物，以SmaI 和EcoR I 雙酶切下游同源臂的PCR 產(chǎn)物后依次克隆至pSET4S（pSET4S 為37 ℃溫度敏感型自殺質(zhì)粒）載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后命名為pSET4S-P。將pSET4S-P 電轉(zhuǎn)入SC-19 菌株，3 h 后涂布于含Spc 的TSA 瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落于含Spc 的TSB 液體培養(yǎng)基，于28 ℃擴大培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)物（1∶100）轉(zhuǎn)接至不含Spc的TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，涂布于不含Spc 的TSA 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)至長出單菌落并挑取單菌落分別涂布于含Spc 和不含Spc 的TSA 瓊脂平板，陽性菌株不能在含Spc的TSA瓊脂平板上生長。

分別提取SC-19和上述陽性菌株的基因組，利用potA基因檢測引物PA-F/PA-R 經(jīng)PCR 鑒定，以SC-19基因組作為陽性對照，ddH2O 為陰性對照；分別提取SC-19和陽性菌株的總蛋白，以鼠源PotA 蛋白多克隆抗體（1∶1 000）作為一抗，羊抗鼠IgG（H+L）（1∶10 000）作為二抗，經(jīng)western blot 鑒定，上述鑒定結(jié)果正確的菌株即為potA基因缺失菌株，命名為ΔpotA。

1.4 potA基因缺失對SS2 形態(tài)影響的觀察分別挑取SC-19 和ΔpotA的單菌落于TSB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至OD600nm約為0.5～0.6 時，取培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色后，使用100 倍光學(xué)顯微鏡觀察。另外取培養(yǎng)物經(jīng)戊二醛固定、鋨酸固定、丙酮脫水、樹脂和丙酮混合滲透、包埋和聚合、制備超薄切片和染色后，使用透射電鏡觀察。同時取培養(yǎng)物經(jīng)涂片、固定，再經(jīng)30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇依次脫水，真空冷凍干燥，粘附于呈物臺，離子噴金后，使用掃描電鏡觀察。

1.5 potA基因缺失對SS2 生長速率影響的檢測分別挑取SC-19 和ΔpotA單菌落于TSB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，每隔1 h 測定菌液OD600nm值，連續(xù)測定10 h；同時從1 h 開始，每隔2 h 將SC-19 和ΔpotA菌液分別做10 倍倍比稀釋，取106、107和108稀釋的菌液分別涂布TSA 瓊脂平板，每個稀釋度涂布3 個平板，12 h 后菌落計數(shù)，根據(jù)OD600nm的測定和平板的計數(shù)結(jié)果繪制SC-19 和ΔpotA的生長曲線，分析potA基因缺失對SS2 生長速率的影響。

1.6 potA基因缺失對SS2 致病性的影響

1.6.1 感染SC-19 和ΔpotA菌株后小鼠存活率的測定 將50 只雌性昆明系SPF 小鼠隨機分成5 組，每組10 只；以之前已經(jīng)測定的SC-19 對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為1.5×109cfu/只為參考[9]，選擇1×109cfu/只和7×108cfu/只兩個劑量組。1～2 組小鼠分別經(jīng)腹腔注射接種1 mL 濃度為1×109cfu/mL 的SC-19 和ΔpotA；3～4 組小鼠分別經(jīng)腹腔注射接種1 mL 濃度為7×108cfu/mL 的SC-19 和ΔpotA；5 組小鼠經(jīng)腹腔注射接種1 mL 生理鹽水；在一周的觀察期內(nèi)記錄小鼠的死亡情況。

1.6.2 感染SC-19 和ΔpotA菌株后小鼠血液和組織中載菌量的測定 將48 只雌性SPF 昆明小鼠隨機分成3 組，第1 組和第2 組各20 只，第3 組8 只；第1～2 組小鼠分別接種1 mL 濃度為7×107cfu/mL 的SC-19和ΔpotA，第3 組小鼠接種1 mL 生理鹽水作為陰性對照；在接種后的0.5 d、1 d、3 d 和5 d 各取5 只小鼠與陰性對照組2 只小鼠分別采血，并迫殺取其腦、肺和脾組織稱重并經(jīng)勻漿后10 倍倍比稀釋，血液樣品直接10 倍倍比稀釋，涂布于無抗的TSA 瓊脂平板。37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)平板菌落計數(shù)后，計算小鼠各組織和血液的載菌量。

1.7 potA基因缺失對SS2 粘附與侵入細胞影響的檢測將HEp-2 細胞鋪于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待長成單層后，以MOI 0.01 加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SC-19 和ΔpotA，37 ℃孵育2 h。吸出培養(yǎng)液，PBS洗去游離細菌，用無菌雙蒸水裂解細胞后10 倍倍比稀釋并涂布于TSA 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后經(jīng)菌落計數(shù)，該計數(shù)即為粘附與侵入細胞的細菌總數(shù)；侵入細胞的細菌數(shù)測定：PBS 洗滌HEp-2 細胞后，加入含100 μg/mL 氨芐青霉素的DMEM 培養(yǎng)液處理細胞2 h；用無菌雙蒸水裂解細胞后10 倍倍比稀釋并涂布于TSA 瓊脂平板；37 ℃培養(yǎng)過夜后經(jīng)菌落計數(shù)，該計數(shù)即為侵入細胞的細菌數(shù)目。其中，粘附細胞的細菌數(shù)目=粘附與侵入細胞的細菌總數(shù)-侵入細胞的細菌數(shù)。根據(jù)計算結(jié)果分析potA基因缺失對SS2 粘附與侵入細胞能力的影響。

1.8 potA基因缺失對SS2 粘附侵入相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測利用TRIzol 法分別提取對數(shù)生長期（OD600nm≈0.6）的SC-19 和ΔpotA菌株總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)表1 中所列的引物，利用qRT-PCR檢測與SS2 粘附及侵入細胞相關(guān)基因（srtA、aupA、sao、fbps、gapdH、eno、sadP、ccpA和dltA）在SC-19和ΔpotA菌株中轉(zhuǎn)錄水平的差異[10]。擴增程序為95 ℃30 s；56 ℃30 s；72 ℃35 s。每個樣品重復(fù)3次，以16S rRNA 作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt計算結(jié)果，分析potA基因缺失對SS2 粘附侵入相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平影響。

2 結(jié) 果

2.1 ΔpotA菌株的PCR 及western blot 鑒定結(jié)果基因水平鑒定：分別以SC-19 和ΔpotA菌株的基因組為模板，ddH2O 為陰性對照，利用檢測引物PA-F/R，經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果顯示，以SC-19基因組為模板擴增出1.1 kb左右條帶，與potA基因大小一致，以ΔpotA基因組為模板則未擴增出該條帶；Western blot 鑒定結(jié)果顯示，SC-19 菌株在50 ku 處有目的條帶，與PotA蛋白大小相符，ΔpotA菌株則無該條帶（圖1）。上述結(jié)果表明，ΔpotA菌株正確構(gòu)建。

圖1 ΔpotA突變株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果Fig.1 Construction and identification of ΔpotA mutant

2.2 potA基因缺失對SS2 形態(tài)影響的觀察結(jié)果利用革蘭氏染色、掃描電鏡和透射電鏡分別對SC-19 和ΔpotA菌株進行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示，ΔpotA菌株的鏈明顯長于SC-19 菌株（圖2A～圖2C）。隨機選取革蘭氏染色視野中的SC-19 和ΔpotA菌株分別對菌鏈中的細菌個數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，SC-19 菌株60%以上的菌鏈由1～3 個細菌構(gòu)成，而在ΔpotA菌株中由1～3 個細菌構(gòu)成的菌鏈不足40%，二者差異極顯著（P＜0.001），而在4～6 個和8 個以上細菌構(gòu)成的菌鏈中，ΔpotA菌株均極顯著比SC-19 菌株占比多（P＜0.001）（圖2D）。表明potA基因的缺失嚴重影響了SS2 菌鏈的有效形成。

圖2 SC-19和ΔpotA的形態(tài)觀察及鏈長統(tǒng)計Fig.2 Morphology and statistics of length chain of SC-19 and ΔpotA strains

2.3 potA基因缺失對SS2 生長速率影響的檢測結(jié)果通過培養(yǎng)并測定SC-19 和ΔpotA菌株連續(xù)10 h 的OD600nm值，同時，每間隔2 h 對SC-19 和ΔpotA菌株進行TSA 瓊脂平板計數(shù)，并繪制生長曲線和柱狀圖，結(jié)果顯示，ΔpotA菌株的生長速率慢于SC-19菌株，在3 h、5 h、7 h 和9 h 各時間點，ΔpotA菌株的菌落數(shù)均少于SC-19 菌株（圖3）。表明potA基因的缺失降低了SS2的生長速率。

圖3 SC-19和ΔpotA的生長曲線測定及平板計數(shù)統(tǒng)計Fig.3 Growth curves and plate count of SC-19 and ΔpotA strains

2.4 potA基因缺失對SS2 致病性影響的檢測結(jié)果分別將7×108cfu/只和1×109cfu/只兩個劑量的SC-19或ΔpotA菌株經(jīng)腹腔注射接種小鼠，觀察7 d內(nèi)小鼠的感染死亡情況。結(jié)果顯示，在7×108cfu/只劑量組中，感染SC-19菌株的小鼠在感染后第1 d死亡4只，之后再無死亡，小鼠存活率為60%，而感染ΔpotA菌株的小鼠在感染后第1 d死亡4只，第2 d死亡1只，第3 d死亡1 只，之后再無死亡，小鼠存活率為40%（圖4A）；在1×109cfu/只劑量組中，感染SC-19菌株的小鼠在感染后第1 d 死亡2 只，第2 d 死亡2 只，之后再無死亡，小鼠存活率為60%，而感染ΔpotA菌株的小鼠在感染后第1 d 死亡6 只，第2 d 死亡2 只，第3 d 死亡1只，之后再無死亡，小鼠存活率為10%（圖4B）。表明potA基因的缺失導(dǎo)致SS2對小鼠的致病性增強。

將7×107cfu/只的SC-19 和ΔpotA菌株分別經(jīng)腹腔接種小鼠，分別在接種后的0.5 d、1 d、3 d和5 d，利用TSA 瓊脂平板計數(shù)對小鼠的血液、腦、肺和脾組織中的載菌量進行比較分析。結(jié)果顯示，在接種后的第1 d 和第2 d，ΔpotA菌株在小鼠血液中的載菌量顯著低于SC-19 菌株（P＜0.05），之后二者的載菌量再無顯著差異（圖4C），而ΔpotA和SC-19 菌株在小鼠腦、脾和肺組織中的載菌量始終無顯著差異（P＞0.05）（圖4D～圖4F）。表明potA基因的缺失不影響SS2 在小鼠各組織中的定植。

圖4 感染SC-19和ΔpotA后小鼠的存活率、血液和組織中載菌量的檢測結(jié)果Fig.4 Survival curves of mice and bacterial load in blood and organs after infection with strain SC-19 and ΔpotA

2.5 potA基因缺失對SS2 粘附與侵入影響的檢測結(jié)果將SC-19 和ΔpotA菌株分別與HEp-2 細胞共培養(yǎng)，利用TSA 瓊脂平板計數(shù)法分別比較SC-19 和ΔpotA菌株對HEp-2 細胞的粘附和侵入數(shù)量，結(jié)果顯示，和SC-19 菌株相比，ΔpotA菌株對HEp-2 細胞的粘附（P＜0.01）與侵入（P＜0.001）數(shù)量均極顯著升高（圖5A、圖5B）。表明potA基因的缺失增強了SS2 粘附與侵入細胞的能力。

圖5 SC-19和ΔpotA對HEp-2細胞粘附及侵入的檢測結(jié)果Fig.5 Adhesion and invasion ability to HEp-2 cells of strain SC-19 and ΔpotA

2.6 potA基因缺失后SS2 粘附及侵入相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平影響分別以SC-19 和ΔpotA菌株的cDNA模板，利用qRT-PCR 檢測SS2 粘附及侵入相關(guān)基因srtA、aupA、sao、fbps、gapdH、eno、sadP、ccpA和dltA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，除dltA基因的轉(zhuǎn)錄無顯著上調(diào)外，其他基因的轉(zhuǎn)錄均不同程度的上調(diào)，其中srtA、fbps和sadP基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著上調(diào)（Fold change＞2，P＜0.001）（圖6）。表明potA基因的缺失促進了SS2 粘附侵入相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

圖6 SC-19和ΔpotA中粘附及侵入相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.6 Detection of transcriptional level of adhesion and invasion related genes in strain SC-19 and ΔpotA

以上結(jié)果表明，ΔpotA菌株致病性的增強，是由于potA基因缺失后，促進了SS2 粘附侵入相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強了ΔpotA菌株對宿主細胞的粘附及侵入能力，但與ΔpotA菌株對宿主組織的定植能力無關(guān)。

3 討 論

多胺是病原菌內(nèi)重要的多聚陽離子小分子，參與病原菌的許多生理學(xué)過程，對病原菌的正常生長和分裂有著至關(guān)重要的作用[4]。病原菌內(nèi)的多胺含量受多重機制的嚴格調(diào)控，主要是通過病原菌自身的多胺合成途徑和轉(zhuǎn)運途徑來調(diào)節(jié)[11]。近年來，隨著對多胺代謝研究的不斷深入，多胺合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因參與病原菌生長、生物被膜形成、莢膜形成、肽聚糖合成和致病性等方面的研究也均有報道。然而，大部分研究僅是針對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等部分病原菌，但多胺代謝是如何調(diào)控這些病原菌生長和致病性的作用機制尚不明確。因此對多胺代謝及相關(guān)基因功能的研究仍任重道遠。

基于多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)PotABCD 是SS 中唯一的多胺轉(zhuǎn)運子[6]，本研究利用同源重組方法構(gòu)建了potA基因的缺失突變株ΔpotA，以進一步探究potA基因的功能。然而在構(gòu)建回補菌株時，無論是potA基因自身的啟動子還是已被證實的msmK、gidA和stk基因的啟動子均無法驅(qū)動potA基因的正常表達，因此本研究未構(gòu)建potA基因的回補菌株。通過對比分析ΔpotA與SC-19 菌株的形態(tài)和生長速率發(fā)現(xiàn)，potA基因的缺失影響了SS2 的正常生長（包括生長速率和鏈長）。有研究結(jié)果顯示，多胺會影響鏈球菌的生長和其鏈的長度[12]。在體外培養(yǎng)時，肺炎鏈球菌必須依賴膽堿或腐胺才能生長，而肺炎鏈球菌在腐胺存在的條件下，其鏈會顯著增長[13]。本研究中小鼠感染SC-19 和ΔpotA菌株后，小鼠的存活率結(jié)果證明potA基因的缺失增強了SS2 對小鼠的致病力。同樣肺炎鏈球菌中potABCD的缺失、potD基因的缺失或者多胺合成基因cad或speE的缺失也能夠影響病原菌對小鼠的致死能力[12-16]。本研究小鼠各組織中SC-19 和ΔpotA菌株的載菌量均無明顯差異，表明potA基因缺失所致SS2 致病能力的增強與SS2 在小鼠組織中的載菌量無關(guān)。在肺炎鏈球菌中，無論缺失potABCD還是缺失多胺合成基因cad或speE，該菌在小鼠的鼻咽和肺組織中的載菌量均顯著降低[16]，造成二者結(jié)果差異的原因目前尚不清楚。此外，用PotD蛋白免疫小鼠后能夠抑制肺炎鏈球菌在小鼠體內(nèi)的定植和對小鼠的致死率[14-15]，同時，很多與生長、復(fù)制和毒力相關(guān)蛋白的表達均下調(diào)，推測可能與病原菌中多胺含量的降低有關(guān)，但具體致病機制尚不明確[14]。進一步探究SS2 對HEp-2 細胞的粘附及侵入能力發(fā)現(xiàn)，缺失potA基因后SS2 對HEp-2 細胞的粘附及侵入能力均顯著提高，qRT-PCR 結(jié)果也顯示，與SS2 粘附及侵入相關(guān)基因（srtA、fbps和sadP）的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著上調(diào)。其中，srtA編碼的細胞壁錨定蛋白SrtA、sadP編碼的粘附素SadP 和fbps編碼的纖連蛋白結(jié)合蛋白FBPS 均是SS2 中已經(jīng)證實的重要粘附因子，以上蛋白的表達對SS2 的粘附及侵入細胞有重要的促進作用[18-20]，多胺轉(zhuǎn)運子potABCD通過調(diào)控毒力基因影響病原菌致病性的研究在大腸桿菌也有過報道，PotD 能夠刺激大腸桿菌生物被膜基因的表達，促進其生物被膜的形成，從而提高大腸桿菌的環(huán)境適應(yīng)性和致病能力[21]。

綜上所述，potA基因的缺失致SS2 中srtA、fbps和sadP等粘附因子編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，提高了SS2 對宿主細胞的粘附及侵入能力，從而增強了SS2 的致病能力，且與SS2 的生長速率和組織定植能力無關(guān)。本研究為進一步探究SSpotA基因的功能及致病機制提供了參考數(shù)據(jù)。