支氣管哮喘患兒血清小窩蛋白-1水平和叉頭框蛋白M1基因表達(dá)與氣道重塑的相關(guān)性

高 健

(河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院/鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/鄭州市兒童感染與免疫重點實驗室，河南 鄭州 450018)

支氣管哮喘是一種由炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重危害人類健康[1]。支氣管哮喘的主要病理改變?yōu)闅獾姥装Y、氣道重塑及平滑肌功能紊亂，其中氣道重塑可能是誘發(fā)支氣管哮喘患者氣道高反應(yīng)、加速患者病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2-3]。因此，早期評估支氣管哮喘患者氣道重塑并積極采取有效的臨床治療措施對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是廣泛表達(dá)于胞膜窖上的分泌蛋白，在細(xì)胞的分子信號傳導(dǎo)及細(xì)胞遷移、侵襲等多方面有重要作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1可能在調(diào)節(jié)氣道炎癥和保護(hù)哮喘方面發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制尚不清楚[5]。叉頭框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)基因是FOX基因家族成員，在調(diào)控有絲分裂及細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用[6]。WU等[7]研究顯示，F(xiàn)OXM1基因可誘導(dǎo)哮喘患者呼吸道上皮屏障功能障礙。由此可見，Cav-1、FOXM1與哮喘的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但二者與氣道重塑的關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討支氣管哮喘患兒血清Cav-1、FOXM1水平與氣道重塑的相關(guān)性，以期為支氣管哮喘患兒的病情評估及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年7月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的支氣管哮喘患兒為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)兒童無哭鬧嚴(yán)重現(xiàn)象，依從性較好，可配合完成檢測；(3)支氣管哮喘病程>1 a，且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并先天性代謝性疾病、急慢性感染性疾病及免疫系統(tǒng)疾?。?2)合并過敏性哮喘或其他嚴(yán)重肺部疾??；(3)伴有重要臟器功能障礙、惡性腫瘤等。本研究共納入支氣管哮喘患兒178例，其中急性發(fā)作期92例(急性發(fā)作組)、臨床緩解期86例(臨床緩解組)。急性發(fā)作組：男45例，女47例；年齡6～13(9.02±2.32)歲。臨床緩解組：男42例，女44例；年齡6～13(9.16±2.19)歲。急性發(fā)作期患兒根據(jù)病情程度分為輕度組(n=47)和中重度組(n=45)。輕度組：男22例，女25例；年齡6～12(8.98±2.36)歲。中重度組：男23例，女22例；年齡6～13(9.06±2.34)歲。急性發(fā)作組與臨床緩解組、輕度組與中重度組患兒的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 血清Cav-1水平檢測抽取各組患兒入組時清晨空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置30～60 min，3 000 r·min-1離心15 min，取上層血清，置于-80 ℃條件下保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清Cav-1水平，試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測血清中FOXM1 mRNA表達(dá)取待測血清，應(yīng)用RNA提取試劑盒(北京康瑞納生物科技有限公司)提取血清總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Genbank獲得基因號，引物合成由寶生物工程(大連)有限公司完成。FOXM1的上游引物序列為5′-CACAGTACGATACTGCTGTAG-3′，下游引物序列為5′-GTACTCTAGCGGTATGACTCG-3′；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glycolytic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因，GAPDH的上游引物序列為5′-CATATCATCGTGCTACGGATG-3′，下游引物序列為5′-GATCAATACATTCGCAGCTGG-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL：上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，SYBR Green Master Mix(江西江藍(lán)純生物試劑有限公司)25 μL，50 mg·L-1cDNA 5 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算血清FOXM1 mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 肺功能檢查應(yīng)用HI-801型肺功能檢測儀(日本捷斯特公司)檢測患兒肺功能，觀察指標(biāo)包括第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second,FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)，計算FEV1/FVC。

1.5 氣道重塑指標(biāo)檢測各組患兒均行胸部CT掃描，取主動脈弓及氣管分叉上下1 cm、右肺下靜脈和橫隔頂上2 cm處放大圖像，測量支氣管內(nèi)直徑和外直徑，連續(xù)測量2次并取均值，計算支氣管管壁厚度與外直徑的比值(T/D)及支氣管壁占支氣管總橫截面積的百分比(WA)；T/D=(外直徑-內(nèi)直徑)/外直徑，WA=(外直徑的平方-內(nèi)直徑的平方)/外直徑的平方×100%。

2 結(jié)果

2.1 急性發(fā)作組與臨床緩解組患兒血清Cav-1水平及FOXM1 mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1。急性發(fā)作組患兒血清Cav-1水平顯著低于臨床緩解組，F(xiàn)OXM1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于臨床緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 急性發(fā)作組與臨床緩解組患兒血清Cav-1水平及FOXM1 mRNA相對表達(dá)量比較

2.2 急性發(fā)作組與臨床緩解組患兒肺功能及氣道重塑指標(biāo)比較結(jié)果見表2。急性發(fā)作組患兒FEV1、FEV1/FVC顯著低于臨床緩解組，T/D、WA顯著高于臨床緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 急性發(fā)作組與臨床緩解組患兒FEV1、FEV1/FVC、T/D及WA比較

2.3 輕度組、中重度組患兒血清Cav-1水平和FOXM1 mRNA相對表達(dá)量、肺功能指標(biāo)及氣道重塑指標(biāo)比較結(jié)果見表3。中重度組患兒血清Cav-1水平及FEV1、FEV1/FVC顯著低于輕度組，血清中FOXM1 mRNA相對表達(dá)量及T/D、WA顯著高于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 輕度組與重度組患兒血清Cav-1水平和FOXM1 mRNA相對表達(dá)量、FEV1、FEV1/FVC、T/D及WA比較

2.4 急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒血清Cav-1水平、FOXM1 mRNA表達(dá)與肺功能指標(biāo)、氣道重塑指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果見表4。Pearson分析結(jié)果顯示，急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒血清Cav-1水平與FOXM1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.512，P<0.05)；血清Cav-1水平與FEV1、FEV1/FVC呈正相關(guān)，與T/D、WA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清中FOXM1 mRNA表達(dá)水平與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，與T/D、WA呈正相關(guān)(P<0.05)。

表4 急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒血清Cav-1、FOXM1 mRNA與肺功能指標(biāo)、氣道重塑指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

支氣管哮喘是常見的呼吸道疾病之一，目前對其發(fā)病機(jī)制仍缺乏全面的認(rèn)知[9]。支氣管哮喘易反復(fù)發(fā)作且病程較長，在其發(fā)病過程中呼吸道內(nèi)皮組織損傷、平滑肌細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而引起氣流受限、氣道狹窄，導(dǎo)致氣道重塑，加重患者病情[10]。既往研究顯示，肺功能指標(biāo)及氣道重塑指標(biāo)改變均是氣道重塑的重要特征[11-12]，但二者檢測方式復(fù)雜，往往造成患兒依從性較差，無法配合。因此，臨床中可尋找相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)來評估支氣管哮喘氣道重塑情況。

支氣管上皮細(xì)胞作為肺抵御外界刺激的屏障，其功能異常時可分泌大量的促炎因子，激活中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致呼吸道慢性炎癥及氣道重塑的發(fā)生與發(fā)展[13-15]。因此，支氣管上皮細(xì)胞受損也是支氣管哮喘的重要特征之一。WANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1基因轉(zhuǎn)錄因子水平升高可促進(jìn)小鼠支氣管上皮細(xì)胞增殖，提示FOXM1基因在支氣管上皮細(xì)胞受損中可能有重要作用。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期患兒血清中FOXM1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于臨床緩解期患兒，且中重度患兒血清中FOXM1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于輕度患兒，提示FOXM1 mRNA表達(dá)水平可用于評估支氣管哮喘患兒的疾病嚴(yán)重程度，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制有待今后進(jìn)一步探究。Pearson分析結(jié)果顯示，血清中FOXM1 mRNA表達(dá)水平與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，與T/D、WA呈正相關(guān)。在炎癥等病理因素作用下，F(xiàn)OXM1 mRNA表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)可參與支氣管上皮細(xì)胞損傷，造成上皮細(xì)胞屏障功能被破壞，誘導(dǎo)大量促炎因子產(chǎn)生和分泌，炎癥細(xì)胞被激活，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑及呼吸道炎癥的發(fā)生。

胞膜窖在質(zhì)膜上具有高度均勻的結(jié)構(gòu)，近期被描述為杯狀結(jié)構(gòu)，其可參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Cav-1是胞膜窖的主要結(jié)構(gòu)成分，可在呼吸道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)[17-18]。研究顯示，Cav-1可通過影響呼吸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度而發(fā)揮抑制呼吸道炎癥作用[19]。本研究結(jié)果顯示，隨著支氣管哮喘患兒病情加重，其血清Cav-1表達(dá)下調(diào)，Cav-1有望成為支氣管哮喘抗炎治療的新靶點。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒血清Cav-1水平與FOXM1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；血清Cav-1水平與FEV1、FEV1/FVC呈正相關(guān)，與T/D、WA呈負(fù)相關(guān)；血清中FOXM1 mRNA表達(dá)水平與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，與T/D、WA呈正相關(guān)；提示Cav-1與FOXM1可能通過互相影響，反向刺激，在氣道重塑和呼吸道炎癥中發(fā)揮重要作用，Cav-1水平越低，F(xiàn)OXM1 mRNA水平越高，支氣管哮喘病情及氣道重塑越嚴(yán)重。

綜上所述，Cav-1和FOXM1基因可能共同參與了支氣管哮喘患兒的氣道重塑。血清Cav-1和FOXM1基因表達(dá)水平對判斷支氣管哮喘患兒病情嚴(yán)重程度有重要價值，為臨床治療提供理論依據(jù)。本研究仍存在不足之處，例如：納入樣本量不足可能會對本研究結(jié)果造成一定偏倚，需加大樣本量繼續(xù)研究；本研究未動態(tài)監(jiān)測Cav-1、FOXM1 mRNA水平與治療效果的關(guān)系，未能明確二者在臨床治療中的具體作用。