HP亞甲藍染色改良法分析

張淑正，張效娟，張占蛟

幽門螺桿菌(helicobacter pylori, HP)是主要存在于胃黏膜上皮和胃腺體黏膜之間的一種細菌，是短桿狀、兩端微彎的革蘭陰性桿菌。HP與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等關系密切。隨著免疫組化和分子病理技術的迅猛發(fā)展，部分病理學檢查中常用的特殊染色方法和項目漸漸被取代或作用被弱化，但顯示HP的特殊染色方法仍然被廣泛應用，且其特染方法種類較多，其中以亞甲藍染色法的HP陽性檢測率相對較高[1-2]。我科室長期對亞甲藍染色法檢測HP進行深入探索和實踐，并在操作細節(jié)上進行改進，找到了一種提升HP切片染色質量的簡便方法，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年6月5日～6月20日南京金域醫(yī)學檢驗所有限公司病理科胃鏡活檢標本100例，均經10%中性福爾馬林固定4～8 h。行常規(guī)活檢取材，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。每例標本均制作成1個蠟塊，每個蠟塊制成3 μm厚白片2張，其中1張設為實驗組(100張)；另1張設為對照組(100張)。

1.2 染液配制亞甲藍染液：亞甲藍0.5 g，硼酸0.5 g溶于100 mL蒸餾水中，充分溶化后，加入亞甲藍0.5 g，再次充分混勻溶化。

1.3 方法

1.3.1傳統(tǒng)方法 切片脫蠟至水，自來水沖洗，置于亞甲藍染液中浸染5 min，自來水洗凈，吹風機冷風吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.2改良法 切片脫蠟至水，自來水沖洗，置于亞甲藍染液染缸中時，旋轉染色架30 s，再靜止于染缸中浸染4.5 min，自來水洗凈，高濃度梯度乙醇(95%、100%、100%)快速脫水各10 s，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.3操作步驟 (1)兩組切片以同樣條件進行前處理：70 ℃恒溫烤箱烤片20 min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各5 min，梯度乙醇(100%、95%、90%、85%、75%)脫二甲苯至水，自來水沖洗。(2)對照組使用傳統(tǒng)方法操作進行染色，實驗組使用改良法操作進行染色。

2 結果

100例標本分成的兩組切片合計200張，均經兩名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。(1)兩種方法之間的診斷結果一致性比較：對照組HP陽性43例，陰性57例；實驗組HP陽性43例，陰性57例。結果顯示：對照組與實驗組的HP陽性率診斷結果完全一致。(2)兩種方法之間的切片質量差異比較：對照組切片透明度一度，背景清潔度一般，見大量散在、彌漫強折光紫黑色小點污染(圖1)；實驗組切片透明度良好，背景清潔，無散在折光小點污染(圖2)。結果顯示：兩者在切片質量上差異有顯著性，改良法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

圖1 傳統(tǒng)方法染色：切片透明度一度，背景清潔度一般，見大量散在、彌漫強折光紫黑色小點污染 圖2 改良法染色：切片透明度良好，背景清潔，無散在折光小點污染

3 討論

HP與消化道多種疾病的發(fā)生相關，臨床診療過程中常需行HP檢測。組織學活檢中，胃鏡活檢組織使用HE染色不易使HP著色，診斷難度大，需使用特殊染色或免疫組化染色才能清晰地顯示HP，從而明確診斷。

HP的檢測方法有多種，組織學檢查中有W-S銀染色法、Giemsa染色法、亞甲藍染色法[3]、BASO染色法[4]、快速尿素酶法[2]、免疫組化法等。亞甲藍法又稱硼酸美藍法，其原理是亞甲藍可溶于水，電離成有色的陽離子，與帶陰離子的HP相結合著藍色[3]。該方法檢測HP陽性率高，操作步驟簡單，試劑來源方便，價格便宜，染液使用壽命長，染色結果可靠，被各醫(yī)院病理科廣泛應用。傳統(tǒng)的亞甲藍法在染色完成后，未進行脫水處理，直接吹風機吹干或自然晾干后封固，導致切片透明度不足，組織上常布滿強折光紫黑色小點或類晶體樣物，增加了診斷難度。

本科室在多年的探索過程中，發(fā)現亞甲藍染液隨著靜止時間的延長，其染液缸底部逐漸產生沉淀物，隨著沉淀物產生的增多，其染色效價開始下降，從而使HP陽性率降低。我科室通過在染色前或染色時進行染液的充分混勻，可使沉淀物重新溶化于染液中，促使染色效價開始回升，HP陽性率得到提升；同時發(fā)現此時使用高濃度乙醇(95%、100%)進行脫水，并不會洗脫或極少洗脫已結合于HP上的染料，其著色強度與傳統(tǒng)方法差異無顯著性；而經過高濃度乙醇(95%、100%)脫水后的組織切片再經二甲苯透明，可使組織切片在整個實驗過程中均保持濕潤狀態(tài)，組織和細胞未暴露在空氣中，其切片透明度比傳統(tǒng)方法顯著提升，且組織上無干擾診斷(甚至可能引起誤診)的強折光小點樣物，無“碳核”現象。