廣東不同玉米基因型幼胚愈傷組織誘導(dǎo)差異研究

何慧怡 陳勇生 崔方慶 齊永文 勞方業(yè)

摘要 [目的]針對廣東玉米品種建立高效遺傳再生技術(shù)體系。[方法]以穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜3個玉米品種的幼胚為外植體，研究N 6培養(yǎng)基中不同濃度的L-Pro、AgNO 3、2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷率的影響。[結(jié)果]較高濃度的Pro（1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈傷組織誘導(dǎo)，而繼代時在N 6培養(yǎng)基中添加29.43 μmol/L AgNO 3則可獲得較多高質(zhì)量的胚性愈傷組織;對3個玉米品種而言，培養(yǎng)基中2，4-D的適宜濃度為1～2 mg/L。3種基因型的外植體均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但基因型和激素種類與濃度均影響愈傷組織誘導(dǎo)效率。[結(jié)論]在實際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同基因型選擇最佳的L-Pro、AgNO 3和2，4-D濃度配比，以獲得較多高質(zhì)量的胚性愈傷組織。

關(guān)鍵詞 玉米;幼胚;愈傷組織;誘

中圖分類號 S513? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）05-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Differences of Callus Initiation from Immature Embryos Among Three Varieties of Maize in Guangdong

HE Hui-yi，CHEN Yong-sheng，CUI Fang-qing et al

（Institute of Nanfan & Seed Industry，Guangdong Academy of Sciences，Guangzhou，Guangdong 510316）

Abstract [Objective]To establish high-frequency regeneration technique system for gene tranformation in maize in Guangdong.[Method]The effects of different concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） in N 6 medium on both the callus induction rate and embryogenic callus rate were analyzed with the immature embryos of 3 maize varieties Suitian 1，Guangnuo 1 and Guangheitian used as materials.[Result]The results showed that the percentage of inducing callus was increased evidently with the addition of L-Proline （1 000-1 300 mg/L），and it was optimal for improving the induction percentage of embryogenic callus to add AgNO 3 （29.43 μmol/L） in N 6 medium during subculture;In addition，for 3 tested maize varieties，the most suitable concentration of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） was 1-2 mg/L callus were grown from immature embryos of all the three genetypes，but both genotypes and types and concentrations of phytohormone affcted the frequency of embryogenic callus formation.[Conclusion]In practice，the optimal concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） were necessary to determined for different genotypes in callus induction in order to increase the induction percentage of embryogenic callus.

Key words Maize;Immature emhryos;Callus;Initiation

基金項目 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS201707）;國家自然科學(xué)基金項目（32072027）;廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃項目（2019B020238001）;廣東省良種重大科研攻關(guān)項目（粵財農(nóng)2019（73）號）。

作者簡介 何慧怡（1981—），女，廣東廣州人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事生物育種研究。*通信作者，研究員，博士，從事生物育種研究。

收稿日期 2021-05-31

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，玉米成為糧食、飼料、經(jīng)濟(jì)兼用的作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有愈來愈重要的地位[1]。其中，玉米組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化研究一直是國內(nèi)外的研究熱點之一[2-10]。自1975年Green等[2]利用玉米幼胚作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)并成功獲得二倍體再生植株以來，國內(nèi)科研人員相繼以幼穗[3-4]、花藥[5]、芽頂端分生組織[6]等作為外植體成功獲得植株再生。然而，由于玉米幼胚具有接種方便及易于愈傷組織誘導(dǎo)等優(yōu)點，因此，幼胚仍是目前玉米組織培養(yǎng)中廣泛使用的外植體類型[4，8-10]。但是，不同基因型玉米幼胚組織培養(yǎng)的效率差異較大[4，11-12]，制約了幼胚在玉米基因工程研究中的應(yīng)用。為了不斷完善以玉米幼胚為外植體的組織培養(yǎng)技術(shù)，使其能更有效地在玉米基因工程上應(yīng)用，該研究在前人研究的基礎(chǔ)上[4，8-12]，采用L 9（33）正交試驗設(shè)計了9種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對3種不同類型的廣東玉米品種（穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜）進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織研究，旨在進(jìn)一步探索建立高效遺傳再生體系的條件，為建立高效的特定玉米品種轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括3個玉米品種，分別為穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜，2018年種植于廣東省科學(xué)院生物工程研究所試驗田塊，8月進(jìn)行人工授粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體幼胚的獲取。在開花授粉期對3個品種進(jìn)行人工套袋，均于授粉后第12天取雌穗剝?nèi)ネ鈱影~，在超凈臺上用75%乙醇浸泡5 min，再用無菌水沖洗3遍，然后用手術(shù)刀削去籽粒上端，使幼胚露出，接著用解剖針取出幼胚，盾片向上，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和繼代。誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基是在N 6基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、硝酸銀（AgNO 3）和L-脯氨酸（L-Pro），采用3因素3水平正交試驗L 9（33）（表1），每處理接種20皿，每皿20個幼胚。7 d后及時切除胚根和胚芽進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，14 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷率，確定最適宜的配比濃度。

1.2.3 培養(yǎng)條件。誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)均為暗培養(yǎng)，溫度為（28±1）℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗甜1號愈傷誘導(dǎo)方差分析

2.1.1 顯著性。由于區(qū)組和C因素項的均方與誤差均方差

異不大，所以計算合并誤差均方進(jìn)行F測驗（當(dāng)方差分析遇到某變異項的均方與誤差均方相差不大，特別是小于誤差均方時，常將該項平方和與誤差平方和合并相加，其相應(yīng)的自由度也合并相加，求得合并誤差均方，以提高F測驗的精度[13]）。結(jié)果表明，穗甜1號在胚性愈傷率方面，A、B因素各水平間達(dá)到極顯著，而在愈傷組織誘導(dǎo)率方面，A、B和C 3因素各水平間都達(dá)到顯著或極顯著（表2）。因此，分別對穗甜1號胚性愈傷率和愈傷組織誘導(dǎo)率的顯著因素水平進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表3、4。

2.1.2 A、B因素各水平間胚性愈傷率比較。由表3可知，在A因素方面，穗甜1號A 2和A 3處理的胚性愈傷率分別極顯著和顯著高于A 1，而A 2和A 3之間無顯著差異;在B因素方面，穗甜1號B 2處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈傷率極顯著高于B 1。

從表2方差分析結(jié)果中各因素的F值大小可確定穗甜1號在胚性愈傷率方面的因素主次順序為B、A、C;根據(jù)多重比較結(jié)果（表3）可知，A因素最優(yōu)水平為A 2，B因素最優(yōu)水平為B 2，C因素不顯著，其因素水平可任取，故該試驗穗甜1號胚性愈傷率的最優(yōu)處理組合為A 2B 2C 0，即最優(yōu)處理組合是1 000 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2，4-D 3種濃度均可。

2.1.3 A、B、C因素各水平間愈傷組織誘導(dǎo)率比較。由表4可知，在A因素方面，穗甜1號A 3處理的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于A 1，A 2介于A 1和A 3之間，且與A 1、A 3之間均無顯著差異;在B因素方面，穗甜1號B 2和B 1處理的愈傷組織誘導(dǎo)率分別極顯著和顯著高于B 3，而B 2和B 1之間無顯著差異;在C因素方面，穗甜1號C 2和C 3處理的愈傷組織誘導(dǎo)率均顯著高于C 1，而C 2和C 3之間無顯著差異。

從方差分析結(jié)果（表2）中各因素的F值，可確定穗甜1號在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的因素主次順序亦為B、A、C;根據(jù)表4的多重比較結(jié)果可知，A因素最優(yōu)水平為A 3，B因素最優(yōu)水平為B 2，C因素較優(yōu)水平為C 2和C 3，故該試驗穗甜1號在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的最優(yōu)處理組合應(yīng)為A 3B 2C 2或A 3B 2C 3，即最優(yōu)處理組合是1 300 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2或3 mg/L 2，4-D。

2.2 廣糯1號愈傷誘導(dǎo)方差分析

2.2.1 正交試驗結(jié)果及顯著性。根據(jù)廣糯1號愈傷誘導(dǎo)正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，廣糯1號在胚性愈傷率方面，B、C因素各水平間達(dá)到極顯著，而在愈傷組織誘導(dǎo)率方面，B因素各水平間達(dá)到極顯著。因此，分別對廣糯1號胚性愈傷率和愈傷組織誘導(dǎo)率的顯著因素水平進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表6、7。

2.2.2 B、C因素各水平間胚性愈傷率比較。由表6可知，在B因素方面，廣糯1號B 2處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈傷率極顯著高于B 1;在C因素方面，廣糯1號C 2處理的胚性愈傷率極顯著高于C 3和C 1，C 3和C 1間的胚性愈傷率無顯著差異。

從方差分析結(jié)果（表5）中各因素F值大小可確定廣糯1號在胚性愈傷率方面的因素主次順序為B、C、A，其中A因素不顯著，因此其水平可任取。由表6可知，B因素最優(yōu)水平為B 2，C因素最優(yōu)水平為C 2，故該試驗廣糯1號在胚性愈傷率方面的最優(yōu)處理組合應(yīng)為A 0B 2C 2，即最優(yōu)處理組合是L-Pro 3種濃度均可，29.43 μmol/L AgNO 3，2 mg/L 2，4-D。

2.2.3 B因素各水平間愈傷組織誘導(dǎo)率比較。由表7可知，在B因素方面，廣糯1號B 1和B 2處理的愈傷組織誘導(dǎo)率間無顯著差異，但均極顯著高于B 3。

從方差分析結(jié)果（表5）中各因素F值大小可確定廣糯1號在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的因素主次順序為B、C、A;由于A、C因素均不顯著，因素水平均可任取，B因素B 1和B 2水平較優(yōu)，故廣糯1號在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的最優(yōu)處理組合應(yīng)為A 0B 1C 0或A 0B 2C 0，即最優(yōu)處理組合是L-Pro和2，4-D 3種濃度均可，不添加AgNO 3或AgNO 3濃度為2943? μmol/L。

2.3 廣黑甜愈傷誘導(dǎo)方差分析2.3.1 正交試驗結(jié)果及顯著性分析。F測驗結(jié)果（表8）表明，廣黑甜在胚性愈傷率和愈傷組織誘導(dǎo)率方面，A、B、C 3因素各水平間均達(dá)到極顯著差異，因此，分別對廣黑甜胚性愈傷率和愈傷組織誘導(dǎo)率的各因素各水平進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表9、10。

2.3.2 各因素水平間胚性愈傷率比較。由表9可知，在A因素方面，廣黑甜A 3處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于A 2和A 1， A 2極顯著高于A 1;在B因素方面，廣黑甜B(yǎng) 2和B 3處理的胚性愈傷率均極顯著高于B 1，而B 2和B 3之間無顯著差異;在C因素方面，廣黑甜C 1處理的胚性愈傷率極顯著高于C 2和C 3，而C 2和C 3之間無顯著差異。

由表8方差分析結(jié)果中各因素F值大小可確定廣黑甜在胚性愈傷率方面的因素主次順序為A、B、C;根據(jù)多重比較結(jié)果（表9），A因素較優(yōu)水平為A 3，B因素較優(yōu)水平為B 2和B 3，C因素最優(yōu)水平為C 1，故廣黑甜在胚性愈傷率方面的較優(yōu)處理組合應(yīng)為A 3B 2C 1或A 3B 3C 1，即較優(yōu)處理組合是1 300 mg/L L-Pro，29.43或58.86? μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

2.3.3 廣黑甜各因素水平間愈傷組織誘導(dǎo)率比較。

由表10可知，在A因素方面，廣黑甜A 3處理的愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于A 2和A 1，A 2極顯著高于A 1;在B因素方面，廣黑甜B(yǎng) 1和B 2處理的愈傷組織誘導(dǎo)率均極顯著高于B 3，而B 1和B 2之間無顯著差異;在C因素方面，廣黑甜C 1處理的愈傷組織誘導(dǎo)率分別顯著和極顯著高于C 3和C 2，C 3極顯著高于C 2。

從方差分析結(jié)果（表8）中各因素F值大小可確定廣黑甜在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的因素主次順序亦為 A、B、C;根據(jù)表10的多重比較結(jié)果可知，A因素最優(yōu)水平為A 3，B因素為B 1和B 2，C因素為C 1，故廣黑甜在愈傷組織誘導(dǎo)率方面的最優(yōu)處理組合應(yīng)為A 3B 1C 1或A 3B 2C 1，即最優(yōu)處理組合為1 300 mg/L L-Pro，不添加AgNO 3或29.43? μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基中2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度的確定

在一定的濃度范圍內(nèi)，AgNO 3有利于玉米愈傷組織誘導(dǎo)[14-16]，也證實一些特殊基因型的誘導(dǎo)必須添加AgNO 3 [17]。Songstad等[18]研究認(rèn)為，植物細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生乙烯，在密閉的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，乙烯積累到較高濃度就會影響到植物細(xì)胞的生長發(fā)育;而Ag+是一種較好的乙烯活性抑制劑，能通過競爭性結(jié)合細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白，從而起到阻止或降低乙烯的作用。王漢寧等[19]通過試驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加AgNO 3，可明顯防止褐化現(xiàn)象發(fā)生。但也有研究發(fā)現(xiàn)AgNO 3在誘導(dǎo)形成愈傷組織的作用方面效果不明顯[20]。

該研究發(fā)現(xiàn)，對于甜玉米品種穗甜1號，適當(dāng)添加AgNO 3（濃度為29.43 μmol/L）有利于其幼胚愈傷組織誘導(dǎo);而對于糯玉米品種廣糯1號和廣黑甜，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO 3對提高愈傷組織的誘導(dǎo)效果不明顯，但在繼代時添加AgNO 3（濃度為29.43 μmol/L），可獲得較多高質(zhì)量的胚性愈傷組織。

L-Pro有促進(jìn)玉米愈傷組織胚性化的作用[21]。付鳳玲等[22]研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中L-Pro濃度對玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響，在N 6培養(yǎng)基中添加適量L-Pro，可提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率;竇秉德等[20]研究發(fā)現(xiàn)，添加了L-Pro的培養(yǎng)基在出愈率和愈傷質(zhì)量方面均明顯優(yōu)于未添加的培養(yǎng)基，因此也認(rèn)為添加L-Pro是必要的。筆者研究發(fā)現(xiàn)，對3個參試玉米品種而言，較高濃度L-Pro（濃度為1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈傷組織誘導(dǎo)，這與李金紅等[23]的試驗結(jié)果一致。

禾谷類作物組織培養(yǎng)和體細(xì)胞胚性誘導(dǎo)過程中，2，4-D的應(yīng)用十分普遍，主要起脫分化作用[19]。已有研究表明[10，24]，在玉米幼胚培養(yǎng)中，添加2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵因子，且隨著添加的2，4-D濃度增大，愈傷組織誘導(dǎo)率呈拋物線形變化，當(dāng)濃度繼續(xù)升高時，愈傷組織的誘導(dǎo)率有所下降，因為高濃度的2，4-D易導(dǎo)致體細(xì)胞無性系變異[25]。該試驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中2，4-D為1～2 mg/L時，對3個玉米品種的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，這與上述的研究結(jié)果基本一致。

3.2 不同基因型誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最佳的2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度配比不同

該試驗的3個參試玉米品種中，穗甜1號為甜玉米品種，其在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D為2或3 mg/L時，有利于誘導(dǎo)愈傷組織;而在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 000 mg/L、2，4-D 3種濃度均可時，其胚性愈傷率表現(xiàn)好。

廣糯1號為糯玉米品種，其在不添加AgNO 3或濃度為29.43 μmol/L、L-Pro和2，4-D 3種濃度均可時，其愈傷組織誘導(dǎo)率較好;而在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、2，4-D為2 mg/L、L-Pro 3種濃度均可時，其胚性愈傷率較好。

廣黑甜為紫糯玉米品種，不添加AgNO 3或濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D濃度為1 mg/L時，其愈傷組織誘導(dǎo)率較好;AgNO 3濃度為29.43或58.86 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D濃度為1 mg/L時，其胚性愈傷率較好。

綜上，對于該研究供試的3個不同玉米品種類型，試驗通過幼胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但基因型和激素種類與濃度均能影響愈傷組織誘導(dǎo)效率，即基因型和培養(yǎng)基中激素的種類與濃度之間存在相互作用，不同基因型間在相同培養(yǎng)條件下或同一基因型在培養(yǎng)基中含不同種類與濃度的激素時，其愈傷誘導(dǎo)率存在差異，因此，不同基因型的培養(yǎng)基中適宜的2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度配比不同，這與以往的研究結(jié)果一致[4，11-12]。另一方面，植物組織培養(yǎng)技術(shù)是生物工程研究的基礎(chǔ)，是植物遺傳轉(zhuǎn)化與品種改良研究的基本技術(shù)環(huán)節(jié)之一，而禾谷類作物中玉米作為重要的糧食作物和飼料作物，其組織培養(yǎng)要比水稻、小麥等作物困難[10，26]。因此，有必要對每種特定玉米材料進(jìn)行大量試驗以確定對應(yīng)的培養(yǎng)基成分，從而提高愈傷組織誘導(dǎo)效率，獲得高質(zhì)量的胚性愈傷組織。

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