紫莖澤蘭入侵前后根部蠟樣芽孢桿菌含量比較及其對(duì)化感物質(zhì)處理的響應(yīng)

趙云鵬, 楊子豪, 徐 剛, Esteban Rodríguez-Leyva, 楊國慶*

1揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2Posgrado en Fitosanidad, Entomología y Acarología, Colegio de Postgraduados, Texcoco, Mexico

入侵生物如何適應(yīng)新生境建立種群并持續(xù)擴(kuò)張，是入侵生物學(xué)研究的核心問題之一(Sax & Brown,2000)。生物地理比較是揭示外來植物入侵?jǐn)U張機(jī)制的常用方法，一般指以外來植物原產(chǎn)地和入侵地種群為材料，在同質(zhì)園試驗(yàn)條件下，比較揭示外來植物在繁殖特性、化感作用、土壤微生物互作等有利擴(kuò)張的特征變化(Dattaetal.,2019)；一些知名假說，如天敵逃逸假說(Keane & Crawley,2002)、新式武器假說(Callaway & Ridenour,2004)、入侵植物-土壤反饋假說(Vanetal.,2013)等對(duì)這些變化進(jìn)行了詮釋。外來有害植物在入侵地新生境中，將對(duì)根際土壤微生物群落產(chǎn)生影響，這種影響常正反饋?zhàn)饔糜谕鈦碇参?；“入侵植?土壤微生物”互益作用在入侵前后是否被放大/縮小，是揭示“入侵植物-土壤微生物”互作助推外來植物成功入侵機(jī)制的重要依據(jù)(柳旭等,2019; 宋潔蕾等，2019; Dawkins & Esiobu,2018)。此外，化感作用是推動(dòng)一些外來植物入侵后逐漸擴(kuò)張的重要因子(Callaway & Ridenour,2004)，這其中的化感物質(zhì)有著“雙重效應(yīng)”，即經(jīng)過土壤介質(zhì)作用于本地植物的直接效應(yīng)和作用于土壤微生態(tài)環(huán)境后產(chǎn)生偏利于入侵植物的間接效應(yīng)，后者的作用更持續(xù)(Inderjitetal.,2011b)。已有研究證實(shí)，外來植物入侵對(duì)伴生植物的化感作用會(huì)不同程度地增強(qiáng)(Callaway & Ridenour,2004)，而對(duì)根際有益菌的作用還需進(jìn)一步研究。

紫莖澤蘭Ageratinaadenophora(Spreng.)作為一種世界惡性入侵雜草，其入侵?jǐn)U張機(jī)制受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注(Dattaetal.,2019； Wanetal.,2010)。和原產(chǎn)地相比，紫莖澤蘭在入侵地發(fā)生了多方面有利擴(kuò)張的適應(yīng)性變化，如資源再分配(孫昂等, 2020)、化感作用增強(qiáng)(Inderjitetal.,2011a)、抗蟲性增加(Linetal.,2020)、氮分配平衡變動(dòng)(Fengetal.,2009)等；在入侵地，紫莖澤蘭與其根際微生物互作的內(nèi)在機(jī)制也正被逐漸“解密”，如：紫莖澤蘭入侵后，其根際微生物介導(dǎo)加速土壤氮代謝(Zhaoetal.,2019)，削弱微生物群落對(duì)根際的化感作用(Lietal.,2017)，改變微生物群落對(duì)自身的偏利效應(yīng)(Niuetal.,2007)，促使根際土壤聚集有益真菌和細(xì)菌(如蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus等)(Fangetal.,2019a,2019c; Zhangetal.,2020)。Sunetal.(2021)研究證實(shí)，紫莖澤蘭可通過根系分泌物促進(jìn)根際有益菌蠟樣芽孢桿菌的增加，這種變化又對(duì)其自身生長產(chǎn)生正反饋?zhàn)饔?，但這種互作效應(yīng)在入侵前后的差異如何不得而知。為此，本研究通過比較紫莖澤蘭入侵地種群根部蠟樣芽孢桿菌含量與原產(chǎn)地種群的差異，及其對(duì)紫莖澤蘭化感物質(zhì)的響應(yīng)，為揭示紫莖澤蘭與有益菌互作在入侵前后的變化及其機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

入侵地3個(gè)種群(C1、C2、C3)種子分別取自紫莖澤蘭入侵地云南省昆明市盤龍區(qū)(25°12′40.1″N, 102°74′53.8″E)、西山區(qū)(25°01′98.4″N, 102°66′51.1″E)與臨滄市(23°87′47.0″N, 100°16′98.0″E)；原產(chǎn)地3個(gè)種群(M1、M2、M3)種子由農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制中心提供，采集自墨西哥的San Pablo lxayoc(19°28′00.5″N, 98°47′12.0″W)、Nezahualcoyotl(19°23′11.9″N, 99°03′15.3″W)、Ciudad de Mexico(19°19′07.9″N, 99°10′57.1″W)。在溫度(25±1)℃、濕度60%±5%、光周期14L∶10D的人工氣候箱內(nèi)培育原產(chǎn)地與入侵地紫莖澤蘭不同種群的種子，種子發(fā)芽后培育1個(gè)月，挑選各種群長勢(shì)一致的幼苗150株左右移栽至育苗盆中(刁躍琿等，2019)，置于溫室內(nèi)(溫度約25 ℃，濕度約45%，自然光照)培養(yǎng)，并定期澆水，保證每個(gè)育苗盆澆水量相同。幼苗種植所用土壤均取自云南臨滄市紫莖澤蘭重度入侵地區(qū)，種植密度分別為5、10、15株·m-2。此外，在云南重度入侵地采集紫莖澤蘭植株及其根際土壤于一個(gè)育苗盆，同時(shí)單獨(dú)取重度入侵地土壤用于后續(xù)的葉片淋溶液或根系分泌液處理。

1.2 方法

1.2.1 根系蠟樣芽孢桿菌含量測(cè)定 取培育的原產(chǎn)地和入侵地各種群的紫莖澤蘭2年生植株(種植密度為10株·m-2)各5株，清洗、剪下根部并浸泡于70%乙醇中30 s，再用流水反復(fù)沖洗、晾干，然后剪碎置于研缽中并添加液氮研磨成粉狀，收集粉狀物保存于4 ℃冰箱中待測(cè)。使用DNeasy?PowerPlant?Kit(QIAGEN?，德國)試劑盒提取植株根系的DNA，然后通過NanoDrop紫外分光光度儀測(cè)定DNA濃度并對(duì)其進(jìn)行qPCR定量(Bio-Rad CFX96) 擴(kuò)增檢測(cè)，具體方法參考Sunetal.(2021)的研究方法。

1.2.2 根際土壤蠟樣芽孢桿菌含量測(cè)定 分別采集紫莖澤蘭1年和2年生的原產(chǎn)地和入侵地各種群紫莖澤蘭植株不同種植密度下的根際土壤，土壤先用篩子(直徑為0.42 mm)除去雜質(zhì)，隨后保存在4 ℃下待測(cè)。使用DNeasy?PowerSoil?Kit (QIAGEN?，德國)試劑盒提取土壤DNA，每個(gè)處理重復(fù)5次，測(cè)定方法參考Sunetal.(2021)的研究方法。

1.2.3 葉片淋溶液、根系分泌液處理后土壤蠟樣芽孢桿菌含量測(cè)定 紫莖澤蘭葉片淋溶液制備：分別取原產(chǎn)地與入侵地1年生紫莖澤蘭植株(種植密度10株·m-2)葉片10 g,剪碎浸泡于100 mL去離子水中，24 h 后，依次通過4層濾紙及0.45 μm Micro PES膜進(jìn)行過濾，過濾后的淋溶液保存于4 ℃冰箱備用(楊國慶等,2008)。紫莖澤蘭根系分泌液制備：取原產(chǎn)地與入侵地1年生紫莖澤蘭植株(種植密度10株·m-2)，清洗根部后，整株移至300 mL 蒸餾水中，1周以后收集根系分泌液。根系分泌液通過4層濾紙過濾，再通過 0.45 μm Micro PES 膜過濾，然后保存于4 ℃冰箱備用(Yangetal.,2016)。

處理：在培養(yǎng)皿中添加25 g土壤，隨后分別添加紫莖澤蘭原產(chǎn)地和入侵地6個(gè)種群的葉片淋溶液或根系分泌液(10 mL)，對(duì)照添加10 mL水，攪拌均勻后加封口膜，置于黑暗環(huán)境中。在處理1、5、9 d后測(cè)定土壤中蠟樣芽孢桿菌含量，每個(gè)處理重復(fù)5次，蠟樣芽孢桿菌含量測(cè)定方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，采用LSD法 One-Way ANOVA 比較6個(gè)種群的均值，做顯著性檢驗(yàn)；使用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)，處理間用不同的字母表示彼此在5%水平上存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 原產(chǎn)地與入侵地種群根系蠟樣芽孢桿菌含量比較

紫莖澤蘭原產(chǎn)地與入侵地種群根系蠟樣芽孢桿菌測(cè)定結(jié)果(圖1)表明，入侵地種群的含量均不同程度地高于原產(chǎn)地種群，其中入侵地種群C1、C2、C3分別比原產(chǎn)地種群M1、M2、M3的含量高911%、25%、170%，1172%、62%、247%，968%、36%、192%(F=39.23,P<0.01)。

圖1 原產(chǎn)地與入侵地紫莖澤蘭種群植株根系蠟樣芽孢桿菌的含量Fig.1 Abundance of B. cereus in the roots of A. adenophora plants from native and invasive populationsM1、M2、M3：原產(chǎn)地種群；C1、C2、C3：入侵地種群；不同小寫字母表示不同種群間的差異顯著(P<0.05)。M1, M2, M3: Native populations of A. adenophora；C1, C2, C3: Invasive populations of A. adenophora.Different lowercase letters indicate significant difference among different populations (P<0.05).

2.2 原產(chǎn)地與入侵地根際土壤蠟樣芽孢桿菌含量比較

由圖2可知，3個(gè)種植密度下，2年生紫莖澤蘭種群根際土壤蠟樣芽孢桿菌含量較1年生的均有所增加，入侵地種群不同程度地高于原產(chǎn)地種群，并在2年生的5株·m-2種植密度下表現(xiàn)較為明顯。1年生15株·m-2種植密度的入侵地紫莖澤蘭各種群的根際土壤蠟樣芽孢桿菌含量顯著高于原產(chǎn)地種群M2，入侵地種群C1、C2和C3的根際土壤蠟樣芽孢桿菌含量分別是M2的2.14倍、1.71倍和1.83倍；2年生的5株·m-2種植密度下入侵地種群C3是原產(chǎn)地種群M2的2.4倍，10株·m-2種植密度下入侵地種群C1是原產(chǎn)地種群M1的2.76倍。

圖2 原產(chǎn)地與入侵地紫莖澤蘭1年生(A)和2年生(B)植株根際土壤中蠟樣芽孢桿菌含量Fig.2 Abundance of B. cereus in rhizosphere soils from one-year plants (A) and two-year plants (B) of native and invasive A. adenophoraM1、M2、M3：原產(chǎn)地種群；C1、C2、C3：入侵地種群；不同小寫字母表示不同種群間的差異顯著(P<0.05)。M1, M2, M3: Native populations of A. adenophora；C1, C2, C3: Invasive populations of A. adenophora.Different lowercase letters indicate significant difference among different populations (P<0.05).

2.3 紫莖澤蘭葉片淋溶液處理對(duì)土壤中蠟樣芽孢桿菌含量的影響

由圖3可知，隨著處理時(shí)間的延長，土壤中蠟樣芽孢桿菌含量增加；和空白對(duì)照相比，紫莖澤蘭入侵地種群葉片淋溶液處理后土壤中蠟樣芽孢桿菌含量的增加幅度不同程度地高于原產(chǎn)地種群處理的。處理1 d后，入侵地種群C2、C3與原產(chǎn)地種群M2、M3淋溶液處理的土壤蠟樣芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照(F=33.20，P<0.01)，入侵地種群處理后土壤蠟樣芽孢桿菌含量總平均值較對(duì)照增加28%，而原產(chǎn)地處理后增加了19%。5 d后，入侵地種群C1、C3與原產(chǎn)地種群M3處理后的含量也顯著高于對(duì)照(F=47.44，P<0.01)，入侵地種群處理后菌含量的總平均值較對(duì)照增加56%，而原產(chǎn)地處理后增加了24%。到處理9 d后，入侵地與原產(chǎn)地所有種群處理后菌的含量顯著高于對(duì)照(F=14.37，P<0.01)，處理后菌含量的總平均值較對(duì)照增加了79%(入侵地)和43%(原產(chǎn)地)。

圖3 原產(chǎn)地和入侵地紫莖澤蘭葉片淋溶液處理1(A)、5(B)和9(C) d后的土壤蠟樣芽孢桿菌含量Fig.3 Abundance of B. cereus in soils after treatment with leaves leachates of native and invasive A. adenophora after 1 (A), 5 (B) and 9 (C) d M1、M2、M3：原產(chǎn)地種群；C1、C2、C3：入侵地種群；不同小寫字母表示不同種群間的差異顯著(P<0.05)。M1, M2, M3: Native populations of A. adenophora； C1, C2, C3: Invasive populations of A. adenophora.Different lowercase letters indicate significant difference among different populations (P<0.05).

2.4 紫莖澤蘭植株根系分泌液處理對(duì)土壤中蠟樣芽孢桿菌含量的影響

由圖4可知，紫莖澤蘭根系分泌液處理也促進(jìn)了土壤中蠟樣芽孢桿菌的增長。3個(gè)不同處理時(shí)間的測(cè)定結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，紫莖澤蘭入侵地種群根系分泌液處理對(duì)土壤蠟樣芽孢桿菌增長促進(jìn)逐漸增加，到了處理9 d后，其增量顯著高于原產(chǎn)地種群的。處理1 d后，原產(chǎn)地3個(gè)種群根系分泌液處理的土壤蠟樣芽孢桿菌含量均顯著高于對(duì)照(F=19.87，P<0.01)。處理5 d后，入侵地與原產(chǎn)地所有種群處理后的菌含量顯著高于對(duì)照(F=24.46，P<0.01)。處理9 d后，所有處理的菌含量也顯著高于對(duì)照(F=4.94，P<0.01)，入侵地種群處理后土壤蠟樣芽孢桿菌含量的總平均值比對(duì)照高70%，而原產(chǎn)地種群在處理后增加了62%。

圖4 原產(chǎn)地和入侵地紫莖澤蘭根系分泌液處理1(A)、5(B)和9(C)天后的土壤蠟樣芽孢桿菌含量Fig.4 Abundance of B. cereus in soils after treatment with root exudates of native and invasive A. adenophora after 1 (A),5 (B) and 9 (C) d M1、M2、M3：原產(chǎn)地種群； C1、C2、C3：入侵地種群；不同小寫字母表示不同種群間的差異顯著(P<0.05)。M1, M2, M3: Native populations of A. adenophora；C1, C2, C3: Invasive populations of A. adenophora.Different lowercase letters indicate significant difference among different populations (P<0.05).

3 討論與結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌作為一種根際促生菌，可起到根際固氮作用(Xuetal.,2012)，誘導(dǎo)植物對(duì)病害的系統(tǒng)抗性(Niuetal.,2012)，在土壤中能抑制病原微生物的繁殖(于文清等,2014b)，還能通過與菌根真菌互作促進(jìn)植物生長(于文清等,2014a；Artursson & Jansson,2003)。本研究結(jié)果可見，入侵地紫莖澤蘭種群根內(nèi)與根際土壤中的蠟樣芽孢桿菌含量高于原產(chǎn)地種群。已有報(bào)道證實(shí)紫莖澤蘭在入侵地云南偏利性聚集根際微生物群落(Chenetal.,2019； Fangetal.,2019b)，并且根際蠟樣芽孢桿菌對(duì)紫莖澤蘭存在正反饋效應(yīng)(Sunetal.,2021)。另外，紫莖澤蘭在入侵地生長更好也得益于天敵草食性昆蟲與土壤病原體損害的減少(Balami & Thapa,2017)，但根際土壤菌落較為復(fù)雜，而進(jìn)入植株根內(nèi)的細(xì)菌群落則較為穩(wěn)定(Tanetal.,2017; Gronemeyeretal.,2012)，因此，內(nèi)生菌在植株生長過程中起到較大的作用。本研究結(jié)果顯示，入侵地種群根內(nèi)蠟樣芽孢桿菌含量都顯著高于原產(chǎn)地種群，這可能是紫莖澤蘭入侵后改變了土壤環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)了根際土壤有益菌的生長所致(Niuetal.,2007)。植株根內(nèi)聚集更多的蠟樣芽孢桿菌可能是有益菌對(duì)入侵地紫莖澤蘭正反饋的新特質(zhì)，但這種反饋效應(yīng)如何由根外作用傳導(dǎo)到根內(nèi)導(dǎo)致有益菌增加還有待于進(jìn)一步揭示。

化感物質(zhì)和根部微生物群落互作及其對(duì)植物的反饋效應(yīng)，一直是外來植物適應(yīng)性機(jī)制研究的熱點(diǎn)問題之一，這其中植株淋溶物與根系分泌物的作用必不可少。已有研究證實(shí)，較原產(chǎn)地種群，紫莖澤蘭入侵地種群的化感作用和化感物質(zhì)有所增加(高鑫等,2018; Inderjietetal.,2011b)，這可能會(huì)引起自毒負(fù)效應(yīng)，而根際有益菌(Lietal.,2017)如蠟樣芽孢桿菌可能承載消減這一不利效應(yīng)的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，入侵地紫莖澤蘭植株根部蠟樣芽孢桿菌的含量不同程度地高于原產(chǎn)地的，且入侵地植株淋溶液處理對(duì)菌的增加較原產(chǎn)地的更加有利，在根系分泌液處理的后期測(cè)定中也有所呈現(xiàn)?？梢?，紫莖澤蘭根部蠟樣芽孢桿菌的增加應(yīng)該是多重因素較長時(shí)間累積作用的結(jié)果，包括化感物質(zhì)作用在內(nèi)。實(shí)際上，紫莖澤蘭在入侵地中有的化感物質(zhì)分泌量是比原產(chǎn)地種群多的，雖然本研究中使用的是等量處理，如果在考慮自然生境下入侵地化感物質(zhì)量更多的因素下，將更加有利于入侵地紫莖澤蘭根部蠟樣芽孢桿菌的增加。此外，原產(chǎn)地紫莖澤蘭植株的根系分泌液中，在化感物質(zhì)組成和含量上與入侵地植株的存在差異，導(dǎo)致其在入侵地新穎的土壤環(huán)境下對(duì)蠟樣芽孢桿菌促生作用在短期內(nèi)更加明顯，這是否是新入侵種群的一種快速適應(yīng)性特質(zhì)，值得進(jìn)一步探究。

紫莖澤蘭入侵后會(huì)呈現(xiàn)資源再分配現(xiàn)象(Fengetal.,2009)，這將會(huì)影響其與土壤微生物互作關(guān)系的改變(Ramirezetal.,2019)；基于蠟樣芽孢桿菌可以偏利促進(jìn)紫莖澤蘭的生長，而紫莖澤蘭的根系分泌液又可促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌的增加(Sunetal.,2021)，這些豐富了蠟樣芽孢桿菌介導(dǎo)的紫莖澤蘭入侵?jǐn)U張機(jī)制的內(nèi)涵。本研究結(jié)果在此基礎(chǔ)上，證實(shí)紫莖澤蘭入侵后與有益菌蠟樣芽孢桿菌的互作有所增強(qiáng)，且化感作用起著一定的作用，為深入挖掘根際有益菌與入侵植物互作的演變機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。