周 靜, 王蕊蕊, 丁芷柔, 胡 平, 郭春暉, 彭 欣, 王瀚棠, 楊振德
廣西大學(xué)林學(xué)院,廣西 南寧530004
桉樹枝癭姬小蜂LeptocybeinvasaFisher & La Salle,隸屬膜翅目Hymenoptera姬小蜂科Eulophidae,2000年首次發(fā)現(xiàn)于中東和地中海地區(qū),主要在桉屬植物的幼嫩部位(嫩枝、葉柄及葉片主脈)產(chǎn)卵形成蟲癭,導(dǎo)致葉片變形,嚴重時甚至影響桉樹的光合作用和營養(yǎng)運輸(Mendeletal.,2004)。2007年,我國在與越南交界的東興市首次發(fā)現(xiàn)該害蟲(吳耀軍等,2009),該蟲危害范圍廣、傳播迅速,自入侵我國后,分布于廣西、廣東、海南、江西和云南等省(自治區(qū))(寇冀蒙等,2020),高度適生區(qū)包括海南、廣西、廣東3個省(區(qū))全范圍及四川、貴州、浙江等省的大部分地區(qū)(黃夢伊等,2020),嚴重影響我國桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
昆蟲體內(nèi)擁有豐富的細菌、真菌和酵母等微生物類型,細菌可為宿主昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì),合成昆蟲所必需的氨基酸、維生素等化合物(鐘勇等,2020; Douglas,2015; Luetal.,2016)。共生微生物主要定殖于昆蟲的體表、腸道和細胞內(nèi),為昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時影響昆蟲的生長發(fā)育與行為,甚至提高宿主的防御與解毒功能,協(xié)助其入侵(張焱等,2016; 張振宇等,2017; Luetal.,2016)。
目前,對桉樹枝癭姬小蜂的研究局限于生物學(xué)特性(Udagedaraetal.,2014; Vanegas-Ricoetal.,2015)、天敵(馮夢霞等,2016; Benjakhun & Kosol,2019; Bushetal.,2018)及環(huán)境對其產(chǎn)生的影響(陳元生等,2020)等方面。據(jù)報道,其伴生細菌能夠降解桉樹次級代謝物質(zhì)、促進入侵進程(寇冀蒙等,2020)。Guoetal., (2020)、王蕊蕊等(2018,2019)探討了不同性別和季節(jié)對桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)細菌多樣性的影響,但不同寄主植物對該蟲體內(nèi)細菌多樣性的影響尚未見報道。本研究利用高通量測序技術(shù)對2種不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌種類及多樣性進行了研究,旨在闡明桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌在寄主適應(yīng)中的作用,為通過干擾蟲體內(nèi)微生物群落多樣性及平衡狀態(tài)進行桉樹枝癭姬小蜂的微生態(tài)防治提供新思路。
桉樹枝癭姬小蜂分別采自廣西大學(xué)林學(xué)院校內(nèi)教學(xué)實踐基地網(wǎng)室中隔離種植的2種2年生桉樹,即巨園桉(Eucalyptusgrandis×Eucalyptustereticornis)DH201-2和窿緣桉(Eucalyptusexserta)。2018年7月分別采集每種桉樹上剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲。
參考Guoetal.(2020)的方法分別將采集的剛羽化健康的桉樹枝癭姬小蜂在無菌條件下,用無菌水清洗3次,再用75 % 酒精浸泡1 min后用無菌水清洗,最后用1‰ HgCl2浸泡3 min,并用無菌水清洗5~6次,按照Power Soil?DNA Isolation kit 說明書提取各樣品總DNA,提取的DNA放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存,每個樣品50頭雌成蟲。將凍存的所有DNA樣品送至北京百邁客生物科技有限公司,應(yīng)用Illumina HiSeq 2500平臺進行高通量測序。利用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增V3+V4區(qū)間片段。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,進行15個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保溫。PCR反應(yīng)體系:DNA模板60 ng,338F (10 μmol·L-1)1.5 μL,806R (10 μmol·L-1)1.5 μL,Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL,High GC Enhancer10 μL,Buffer 10 μL,dNTP1 μL,ddH2O補足至總體積50 μL。
使用FLASH v 1.2.11軟件對每個樣品的reads進行PE reads拼接,再使用Trimmomatic v 0.33軟件過濾,最后利用UCHIME v 4.2軟件得到有效序列。統(tǒng)計各階段的序列數(shù)、有效率等參數(shù)來評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。使用QIIME v 1.8.0軟件在97%相似度水平下進行聚類,統(tǒng)計各樣品中含有的OTU (operational taxonomic units)數(shù)目,以及每個OTU中含有序列的數(shù)目。在97%相似度水平下,使用Mothur v 1.30軟件(http:∥www.mothur.org/)計算菌群豐富度指數(shù)(Chao1值、Ace值)、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))及OTU覆蓋率,進行Alpha多樣性分析。使用Mothur v 1.30軟件與SILVA數(shù)據(jù)庫(http:∥www.arb-silva.de/)PyNAST算法和RDP Classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行序列比對及物種注釋得到對應(yīng)的物種分類信息,制作物種豐度表和群落結(jié)構(gòu)圖。
分別對以巨園桉DH201-2和窿緣桉為寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌16S rDNA V3+V4區(qū)進行Illumina HiSeq 2500測序,分別獲得169818、146284對PE Reads;雙端Reads拼接后獲得162586、138694條原始序列;經(jīng)過濾優(yōu)化后獲得147688、125773條Clean tags,有效率分別為86.8%、85.75%,均高于85%。去除嵌合體后2個寄主樣品有效序列的平均長度406、409 bp,均大于400 bp,Q20值96.28%、96.21%,均大于95%,Q30值93.05%、92.89%,大于90%,說明在PCR過程中2個寄主樣品產(chǎn)生的嵌合體較少,且每個寄主樣品測序的準確度均較高。
以97%的一致性將2組樣品的有效序列進行聚類分析(圖1),共鑒定出230個細菌OTUs,其中取食巨園桉DH201-2、窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂內(nèi)生細菌物種的OTU數(shù)分別為206和171個,2組樣品共有OTU數(shù)為147,占總OTU數(shù)的63.91%,分別占寄主樣品總OTUs的71.36%(巨園桉DH201-2)、85.96%(窿緣桉),表明以巨園桉DH201-2為寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的細菌種類更多。
圖1 不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌群落OTUs的Venn圖Fig.1 Venn profile of bacterial OTUs in L. invasa with different host
Alpha多樣性主要與群落豐富度和多樣性2個因素有關(guān)。在97%相似度分類水平上,計算Alpha多樣性指數(shù)。通過QIIME(v.1.8.0)計算OTU的Goods_coverage指數(shù)均為100%,說明各樣品文庫覆蓋率好,反映了樣本的真實情況。其中,取食巨園桉DH201-2的蟲體細菌ACE指數(shù)(207.2380)和Chao1指數(shù)(212.0)均高于取食窿緣桉寄主的蟲體細菌樣品(分別為172.5012、173.0),說明取食巨園桉DH201-2的蟲體樣品中細菌群落豐富度更高;另外,取食巨園桉DH201-2的蟲體內(nèi)細菌Simpson指數(shù)(0.8403)高于取食窿緣桉的蟲體細菌樣品Simpson指數(shù)(0.5431),而Shannon指數(shù)(0.6558)低于取食窿緣桉的蟲體細菌樣品Shannon指數(shù)(1.2522),說明取食窿緣桉的蟲體內(nèi)細菌群落多樣性更高;取食巨園桉DH201-2植株的蟲體內(nèi)細菌的Pielou值(0.12)低于以窿緣桉為寄主的樣品(0.24),說明以巨園桉DH201-2為寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌群落的均勻程度更低。
寄主分別為巨園桉DH201-2和窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)共鑒定出230個細菌OTUs,隸屬于14門24綱41目73科123屬,其中有83個精確到了種。取食巨園桉DH201-2的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌得到的注釋數(shù)比取食窿緣桉種群體內(nèi)細菌的注釋數(shù)更多。
根據(jù)不同寄主樣品的OTU及OTU所代表的物種分析可知,桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的16S rDNA基因序列共注釋得到了14個門,分別為變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、藍細菌門Cyanobacteria、梭桿菌門Fusobacteria、Saccharibacteria、軟壁菌門Tenericutes、疣微菌門Verrucomicrobia、TM6_[Dependentiae]、酸桿菌門Acidobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、Tectomicrobia和WWE3。
取食巨園桉DH201-2和窿緣桉寄主的樣品內(nèi)細菌在門分類水平上的相對豐度存在明顯差異(圖2A),從來源于巨園桉DH201-2的樣品中鑒定出了上述14個門,其中優(yōu)勢菌群為變形菌門(95.15%)(百分比為相對豐度,下同),而厚壁菌門(1.57%)、放線菌門(1.50%)和擬桿菌門(1.23%)次之;來源于窿緣桉寄主的樣品中所有序列均被鑒別出,共有10個門(變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍細菌門、梭桿菌門、Saccharibacteria、軟壁菌門、疣微菌門和酸桿菌門),優(yōu)勢菌群為變形菌門(94.01%),其次為擬桿菌門(4.25%)、厚壁菌門(0.81%)和放線菌門(0.46%)。由此可知,2個寄主樣品體內(nèi)細菌的優(yōu)勢菌門均為變形菌門,占比均大于90%,進一步說明在門分類水平上,不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的主要類群具有一定的相似性。
在屬水平上,來源于巨園桉DH201-2和窿緣桉2種寄主的樣品共注釋得到了123個屬(圖2B),菌群豐度前10的類群是立克次氏體Rickettsia、泛菌屬Pantoea、根瘤菌屬Rhizobium、uncultured_bacterium_f_Bacteroidales_ S24-7_group、不動桿菌屬Acinetobacter、擬桿菌屬Bacteroides、丙酸桿菌屬Propionibacterium、微桿菌屬Microbacterium、乳酸桿菌屬Lactobacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus。2種寄主材料體內(nèi)菌群主要屬的分布及優(yōu)勢菌屬所占比例具有明顯的差別。巨園桉DH201-2寄主樣品體內(nèi)菌群共有113個屬,立克次氏體屬為主要優(yōu)勢菌屬,其相對豐度約為93.11%;在窿緣桉寄主樣品體內(nèi)細菌的優(yōu)勢菌屬為立克次氏體屬(73.61%)、泛菌屬(10.84%)和根瘤菌屬(8.01%)。雖然2種寄主材料的優(yōu)勢菌屬均為立克次氏體屬,但其相對豐度值存在較大差異,且次級優(yōu)勢菌屬不同。
圖2 2個寄主樣品體內(nèi)的細菌在門(A)和屬(B)水平上的組成和結(jié)構(gòu)Fig.2 Composition and structure of bacteria in two host samples at phylum(A) and genus(B) levels
昆蟲體內(nèi)分布著復(fù)雜多變的微生物種類,但是不同昆蟲體內(nèi)的微生物種類和含量存在一定的相似性。已有研究表明,厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是昆蟲體內(nèi)細菌的優(yōu)勢菌群,如斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius幼蟲、仁扇舟蛾Closterarestitura(walker)幼蟲、伊凡氏葉螨TetranychusevansiBaker & Pritchard、二斑葉螨Tetranychusurticae(Koch)和荔枝蝽Tessaratomapapillosa(Drury)成蟲體內(nèi)優(yōu)勢菌門均為上述菌門(劉家生,2018; 孫博通等,2017; 朱晗等,2021; Ribeiroetal.,2019),與本研究結(jié)果一致。內(nèi)共生菌Rickettsia也廣泛存在于昆蟲體內(nèi),壯材小蠹Terminalinusspp.、煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)、白蠟蟲EriceruspelaChavannes等昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)立克次氏體為其細菌優(yōu)勢菌屬(呂品等,2019; 薛延韜等,2017; 張玉婷等,2021)。取食2種不同植物的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌優(yōu)勢菌屬也同為立克次氏體,這可能與桉樹枝癭姬小蜂的孤雌生殖有關(guān)。
昆蟲體內(nèi)細菌組成及多樣性不僅受昆蟲種類的影響,還與昆蟲所取食物質(zhì)有關(guān)(魏曉瑩等,2019)。本研究對2種不同寄主條件的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌進行研究,發(fā)現(xiàn)取食2種不同寄主的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的種類和數(shù)量均存在差異,取食窿緣桉的桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)立克次氏體屬細菌的相對豐度更小,且體內(nèi)次優(yōu)勢菌屬的占比更大,這可能與不同食物的營養(yǎng)水平不同或昆蟲對不同食物的消化吸收能力不同有關(guān)。3種取食不同寄主植物的葉蜂(河曲絲葉蜂NematushequensisXiao、落葉松葉蜂PristiphoraerichsoniiHavtig和松阿扁葉蜂AcantholydaposticalisMatsumura)幼蟲腸道細菌組成存在很大差異(張帥帥等,2017);取食柘葉與桑葉的家蠶體內(nèi)優(yōu)勢菌群的組成存在較大的變化(向蕓慶等,2010);取食桑葉的廣食性家蠶體內(nèi)菌群多樣性高于取食人工飼料種群(郝長富等,2019);美國白蛾Hyphantriacunea(Drury)體內(nèi)優(yōu)勢菌屬因取食食料的不同而產(chǎn)生差別,而飼養(yǎng)條件的不同可顯著影響橘小實蠅BactroceradorsalisHendel體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的種類(王洪秀等,2015; 魏丹峰等,2017)。以上研究表明,昆蟲取食食物的不同會影響其體內(nèi)細菌的多樣性,與本試驗的研究結(jié)果相符。也有研究指出,不同樹種的桉葉粗提物對測試菌株的抑菌活性存在顯著差異,這可能是不同品種桉樹的有效成分不同,從而導(dǎo)致抑菌效果存在差異(楊巧麗,2013)。本研究采用的2種寄主為不同品種的桉樹,故推測是由于不同桉樹品種間有效成分的差異導(dǎo)致桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的多樣性和豐富度存在不同,而體內(nèi)細菌種類及群落結(jié)構(gòu)的可塑性變化是桉樹枝癭姬小蜂適應(yīng)不同寄主植物的機制之一,但該假設(shè)有待進一步驗證。
Rickettsia是一種寄生在細胞內(nèi)的專性細菌,所有已知的與脊椎動物有關(guān)的Rickettsia均由節(jié)肢動物傳播,主要為蜱、虱子、螨等,眾多Rickettsia只在節(jié)肢動物中發(fā)現(xiàn),沒有已知的次級宿主(Huangetal.,2017)。研究表明,Rickettsia能操縱宿主昆蟲繁殖、改變生殖方式、降低不良環(huán)境對宿主入侵的影響(Daisukeetal.,2012)。Rickettsia可以影響蚜蟲的顏色,從而降低豌豆蚜被捕食或被寄生的機率(Tsuchidaetal.,2010)。王紫淇等(2020)發(fā)現(xiàn),存留有Rickettsia的棉花植株能夠促進煙粉虱的發(fā)育,提高其存活率及繁殖力,甚至延長其壽命,且煙粉虱體內(nèi)的Rickettsia比存留在棉花植株上的Rickettsia對煙粉虱的影響更大。Giorginietal.(2010)的研究也表明,寄生蜂Pnigaliosoemius的孤雌生殖與Rickettsia有關(guān),感染Rickettsia的寄生蜂僅產(chǎn)生雌性后代,抗生素處理后,寄生蜂的后代幾乎全部為雄蟲。Hagimorietal.(2006)報道了Rickettsia可影響芙新姬小蜂Neochrysocharisformosa的孤雌生殖。桉樹枝癭姬小蜂主要為孤雌生殖,Rickettsia作為其體內(nèi)菌群優(yōu)勢菌屬,可能對桉樹枝癭姬小蜂繁殖產(chǎn)生影響。Nugnesetal.(2015)研究表明,Rickettsia主要存在于桉樹枝癭姬小蜂的卵巢內(nèi),驗證了其對桉樹枝癭姬小蜂孤雌生殖的誘導(dǎo)作用,但具體作用方式有待進一步研究。