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    PLCG1、KIF2B和KIF4B基因與完全受精失敗的相關性分析

    2022-03-21 14:08:20李彥奇趙瓊珍劉金瑞黃衛(wèi)東
    生殖醫(yī)學雜志 2022年3期
    關鍵詞:紡錘體卵母細胞外顯子

    李彥奇,趙瓊珍,劉金瑞,黃衛(wèi)東,2*

    (1.新疆碳智干細胞庫有限公司,圖木舒克 844000;2.新疆佳音醫(yī)院,烏魯木齊 830000)

    體外受精(IVF)技術使女性輸卵管損傷、排卵失敗或男性因素不育的多數(shù)夫婦獲得妊娠,但臨床上仍然存在部分夫婦在IVF周期中出現(xiàn)完全受精失敗(TFF)的情況。TFF是指在一個周期中所有卵母細胞的受精失敗。據(jù)報道,在正常精子存在的情況下,IVF后TFF的發(fā)生率為4%~16%[1]。目前,普遍認為卵母細胞活化失敗(OAF)似乎是導致TFF的主要原因[2]。勒布原理指出精子在受精、促進細胞分裂和父系遺傳方面具有重要作用[3],按照勒布的說法,精子的第二個作用是其特異性蛋白和因子觸發(fā)Ca+2振蕩激活卵母細胞,而且精子中心粒引導卵母細胞和精子核形成合子核[4]。這些研究結果表明,精子在卵母細胞活化、受精卵形成方面都具有積極作用。雖然目前關于TFF的研究主要集中在男性因素,但女性因素也不容忽視。排除卵母細胞儲備減少的周期,TFF率為1%~5%[5]。卵胞質內異常的紡錘體及微管結構會導致染色質異常模式的發(fā)生而影響受精過程[6]。卵母細胞中異常線粒體或三磷酸肌醇(IP3)信號通路導致Ca2+振蕩異常,使激酶/磷酸化酶信號通路異常,皮質反應異常,導致受精失敗[7]。TFF的遺傳原因是未知的,也可能是多種因素造成的,雖然通常歸因于精子因素,也極有可能是卵母細胞異常在其中起到關鍵作用。因此,本研究旨在通過對IVF周期中經歷TFF的夫婦進行全外顯子測序,鑒定篩選與TFF相關的候選基因,并分析其功能,以期為進一步研究其作用機制奠定基礎。

    材料與方法

    一、研究對象

    選取2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院的IVF助孕患者,將IVF后出現(xiàn)TFF的夫婦作為實驗組,納入標準:(1)女性年齡≤40歲;(2)染色體核型正常(46,XN);(3)輔助生殖治療中,女性獲卵數(shù)>4個/周期;(4)周期中所有卵母細胞均受精失?。?5)排除ICSI及補救ICSI。對照組選擇行IVF后至少生育一個正常孩子的夫婦,納入標準:同實驗組(1)、(2)、(3);(4)助孕周期中未見異常受精情況。參照WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊,納入研究的所有男性精液常規(guī)檢查結果均正常。

    根據(jù)納入標準,實驗組共有64對夫婦,對照組共157對夫婦。本研究已通過倫理審查會批準(JKLL-KY20201221-01),所有研究對象均簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.精液常規(guī)檢測:患者手淫取精,充分液化后參照WHO第5版人類精液檢查與處理實驗手冊標準,進行精液常規(guī)分析。

    2.全外顯子測序及基因注釋:采集實驗組64對夫婦和對照組157對夫婦的外周血 5 ml,用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺進行全外顯子組基因測序檢測,AdapterRemoval軟件對測序結果進行處理,使用bwa軟件將數(shù)據(jù)與人類標準參考序列hg19版本比對,經去除重復讀長后,再采用sentieon軟件的Haplotyper算法進行SNP檢測,最后使用GATK的VariantFiltration進行過濾,生成可用于后續(xù)分析的vcf文件。同時對目標區(qū)域的覆蓋度及測序質量進行評估。將所有的SNP與dbSNP以及千人基因組數(shù)據(jù)庫進行基因注釋。

    3.變異基因的篩選及驗證:使用“overlap”法篩選基因突變,該突變僅存在于實驗組中,而對照組中不存在,顯著縮小研究范圍。隨后利用OMIM(https://www.omim.org/)、The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)、Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和GeneCards(http://www.genecards.org/)等公共數(shù)據(jù)庫,對IVF 中TFF的顯著性差異基因位點進行篩選和功能驗證。

    三、統(tǒng)計學分析

    結 果

    一、基礎資料比較

    本研究共納入實驗組64對夫婦,對照組157對夫婦。統(tǒng)計結果顯示,兩組患者在女性平均年齡、獲卵數(shù)、男性平均年齡、精子濃度及精子活力的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

    表1 基礎資料比較(-±s)

    二、兩組患者的差異突變基因分布情況

    根據(jù)不同組別的SNP位點的突變頻率的不同,使用chisq.test(data)命令進行卡方檢驗(chi-square test),選擇P<0.05的位點,在女性和男性群體中分別篩選到812和823個顯著性位點,分別位于606和611個基因上。其中,非同義突變最多,終止變異最少,所有變異皆位于常染色體(表2)。

    表2 基因變異分布情況

    三、兩組患者的顯著性基因頻率統(tǒng)計

    采用“overlap”法,分析實驗組中含有、但對照組沒有的變異位點,同時剔除同義突變。在實驗組女性中獲得148個顯著基因共164個突變位點,在實驗組男性中獲得120個顯著基因共132個突變位點。

    經數(shù)據(jù)庫篩選,將磷酯酶Cγ1(PLCG1)、驅動蛋白家族成員2B(KIF2B)和驅動蛋白家族成員4B(KIF4B)基因作為TFF的候選基因。其中基因PLCG1的rs2228246位點突變屬于雜合突變,實驗組中有4人攜帶變異,突變率為6.15%(4/64),實驗組和對照組存在顯著性差異(P<0.05);在男性實驗組和對照組群體中,基因KIF2B的rs76337756位點和KIF4B的rs10056252位點也屬于雜合突變,分別有3人攜帶,突變率為4.61%(3/64),且在實驗組和對照組中均存在顯著差異(P<0.05)(表3)。

    表3 顯著性基因頻率統(tǒng)計(部分)

    四、候選基因的功能分析及驗證

    經GeneCards(http://www.genecards.org/)和The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)分析工具對PLCG1、KIF2B和KIF4B基因功能進行驗證。PLCG1與IP3 的產生有關,IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細胞內Ca+2釋放。PLCG1基因在子宮、子宮內膜、宮頸組織中高表達,在管周細胞、內皮細胞中高度表達(圖1)。KIF2B基因的突變將導致有絲分裂進展延遲,出現(xiàn)單極或無序紡錘體,以及雙核或死細胞數(shù)量增加。KIF2B基因在睪丸、精母細胞中高度表達,其他組織及細胞中沒有表達(圖2)。KIF4B基因在后期紡錘體動力學和胞質分裂、有絲分裂期間染色體分離中起作用;還可能在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中發(fā)揮作用。KIF4B基因在睪丸組織、精母細胞中高度表達,其他組織及細胞中表達較低(圖3)。

    A:細胞表達特異性;B:組織表達特異性(來源https://www.proteinatlas.org/)

    A:細胞表達特異性;B:組織表達特異性(來源:https://www.proteinatlas.org/)

    A:細胞表達特異性;B:組織表達特異性(來源:https://www.proteinatlas.org/)

    討 論

    全外顯子組只占整個人類基因組的1%~2%,但其中對人類疾病有影響的基因突變有85%[8]。全外顯子組測序可以針對基因組中的蛋白質編碼區(qū)靶向富集外顯子區(qū)域測序。本研究中發(fā)現(xiàn)了4例在IVF周期中發(fā)生PLCG1基因雜合突變的TFF女性患者,在男性群體中發(fā)現(xiàn)了3例KIF2B和3例KIF4B基因突變的TFF患者,這三個基因突變均沒有在對照組中發(fā)現(xiàn)。因此,這3個候選基因突變可能是IVF 中TFF的致病突變位點。

    TFF的原因非常復雜[9]。受精過程涉及一系列連續(xù)的步驟,從精子和卵母細胞膜的識別和融合開始,隨后觸發(fā)持續(xù)的胞質鈣(Ca+2) 振蕩,這是刺激胚胎發(fā)育所必需的,Ca+2振蕩數(shù)小時的持續(xù)是卵母細胞活化的常見信號,并開始復雜的發(fā)育過程以形成受精卵[10]。

    經過GeneCards數(shù)據(jù)庫的基因功能驗證,PLCG1基因位于20號染色體的長臂上,與IP3 的產生有關,而IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細胞內Ca+2釋放。PLCG1基因編碼蛋白在子宮內膜、子宮、宮頸等女性生殖部位有較高表達。該基因編碼蛋白與精子卵母細胞磷脂酶C zeta 1(PLCZ1)同屬磷脂酶C(PLC)家族,該家族成員均具有保守性的C2結構域、EF結構域、PH結構域[11]。大量研究表明,PLCZ1通過IP3途徑參與卵母細胞激活和原核形成,對受精后卵細胞狀態(tài)的激活至關重要[12]。有證據(jù)表明,PLCZ1在胚胎發(fā)育中具有潛在的作用,尤其是在胚胎早期分裂過程中[13]。研究顯示,女性生殖道環(huán)境對精子運輸和受精過程中也具有重要作用[14]。因此,PLCG1基因可能參與女性受精過程中的機制調節(jié),該基因的突變可能導致受精的失敗。

    KIF2B基因位于17號染色體的長臂上,屬于驅動蛋白家族成員,編碼微管運動蛋白,其特征在于驅動蛋白結構域位于多肽中間。KIF2B基因促進微管運動,活躍在中心體上,參與雙極紡錘體組裝、胞質分裂和染色體運動等多個有絲分裂過程中的關鍵事件。KIF2B基因編碼蛋白在睪丸、精母細胞中高度表達,其他組織及細胞中均沒有表達。KIF4B基因位于5號染色體的長臂上,也屬于驅動蛋白家族成員。該基因參與ATP依賴性微管運動活動、有絲分裂胞質分裂、有絲分裂紡錘體中區(qū)組裝等,在后期紡錘體動力學和胞質分裂中起著至關重要的作用,而且在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中也發(fā)揮作用。KIF4B基因編碼蛋白在睪丸組織、精母細胞中高度表達,其他組織及細胞中表達較低。鞭毛是精子的尾巴,是雄性生育和有性繁殖的重要條件,它含有許多由微管蛋白組成的小管。鞭毛必須要以非常精準和協(xié)調的方式跳動,才能使精子逐步游動,否則,則導致男性不育。有研究顯示,微管蛋白糖基化的酶修飾是讓精子保持直線游動的關鍵[15]。中心體參與胞內細胞骨架的形成、有絲分裂紡錘體的形成等許多功能。在一些畸形精子患者中,精子中心體功能表現(xiàn)出受損的情況使得受精產生障礙[16]。精子中心體對于鞭毛的發(fā)生起著至關重要的作用。在鞭毛的形成中,中心體遷移到細胞外圍,以中心粒為基體啟動軸絲的組裝[17],中心粒功能障礙也會導致精子尾部鞭毛的缺失[18]。目前關于KIF2B基因的研究發(fā)現(xiàn),其與腦蛋白疏松癥[19]、肺腺瘤[20]有關;KIF4B基因與肝細胞癌[21]、胰腺癌[22]等疾病有關,在人類受精的研究中都未見報道?;谝陨戏治?,推測KIF2B和KIF4B基因可能參與精子鞭毛的形成及運動,但其具體功能還需進一步研究。

    本研究全外顯子測序技術篩選到與TFF相關的PLCG1、KIF2B和KIF4B這3個基因,通過生物信息方法初步分析了基因功能,但這3個基因在TFF發(fā)生過程中的確切作用及其機制還需進一步探索。

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