“范尼”甲基磺酸乙酯誘變體系的建立和M4代干旱敏感突變體篩選

王 玥， 李玉環(huán)， 李 群， 謝麗瓊

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 烏魯木齊 830046； 2.奇臺(tái)一中， 新疆 昌吉 831100)

亞麻(LinumusitatissimumL.)廣泛栽種在中國(guó)西北西南等地，是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物之一，為一年生草本植物[1]。國(guó)內(nèi)水肥充分的良田多用于主栽糧食作物，因而干旱涼冷之地是亞麻生產(chǎn)未來(lái)發(fā)展的主要方向[2]。干旱主要通過(guò)水分缺失損傷植物，阻礙其正常生長(zhǎng)，水分對(duì)亞麻萌發(fā)和苗期尤為重要，因此這兩個(gè)階段對(duì)干旱脅迫極為敏感。干旱脅迫下，亞麻種子出苗不整齊，單位種植密度減少，產(chǎn)量下降[3]，生育期干旱還會(huì)影響亞麻纖維品質(zhì)。室內(nèi)常用PEG-6000作為滲透脅迫劑模擬水分脅迫，吳文榮[4]研究已為亞麻抗旱篩選體系的建立奠定了基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的雜交育種相比，誘變育種具有育種進(jìn)程短、變異頻率高、性狀改良多等優(yōu)點(diǎn)。甲基磺酸乙酯(EMS, ethyl methane sulfonate)常用于植株誘變進(jìn)行性狀改良，該試劑可改變DNA單個(gè)堿基，并具有較多且較為穩(wěn)定的突變性狀。目前已在玉米[5]、小麥[6]、水稻[7]等多種作物中對(duì)不同農(nóng)藝性狀進(jìn)行了改良。Aghaee等[8]對(duì)萌發(fā)10 d后的亞麻幼苗分別施加6%、12%和18%的PEG-6000，水分虧缺顯著增強(qiáng)了CAT、POD和SOD活性；閆文亮等[9]對(duì)15種亞麻種子進(jìn)行PEG-6000脅迫處理，測(cè)定了發(fā)芽勢(shì)，發(fā)芽率等7個(gè)指標(biāo)，結(jié)果表明，亞麻種子相對(duì)吸水率可反應(yīng)亞麻種子抗旱性強(qiáng)弱。譚義川等[10]采用20% PEG-6000對(duì)19份M4代EMS玉米誘變系模擬干旱脅迫，通過(guò)5個(gè)抗旱性指標(biāo)篩選出4個(gè)抗旱性較好的誘變系；Khalil等[11]利用0.1% EMS誘變2個(gè)甘蔗品種，用28% PEG-6000篩選突變后代，通過(guò)多種生理參數(shù)和15對(duì)簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)獲得ROC 22的抗旱突變株；Boarlaye等[12]利用EMS誘變亞麻，后代中外顯子突變頻率為每28 kb 1個(gè)，共得到13個(gè)純合錯(cuò)義突變和2個(gè)純合無(wú)義突變，并都被遺傳至M3，M4代?？梢?jiàn)利用EMS誘變加PEG篩選的突變體抗旱篩選體系已在多種作物中得到運(yùn)用，但亞麻中還沒(méi)有獲得抗旱相關(guān)突變體的研究。本研究用EMS處理篩選已萌動(dòng)纖用亞麻“范尼”種子的最適條件，通過(guò)M1代成株率建立種子最佳誘變體系，構(gòu)建了“范尼”突變體庫(kù)。PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)M4代突變體進(jìn)行耐旱性評(píng)價(jià)，最終獲得干旱敏感突變體。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為纖用亞麻“范尼”，經(jīng)EMS誘變，2014年—2018年自交至M4代栽培于呼圖壁以及米泉試驗(yàn)田。M4代突變體材料包括：M4-12-1，M4-5-5，M4-8-2，M4-32-4，M4-18-2，M4-6-2，M4-16-1。耐旱性篩選實(shí)驗(yàn)于2019年9月在新疆大學(xué)進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1EMS處理亞麻種子“范尼”

挑選籽粒飽滿無(wú)明顯病狀的種子，26 ℃溫水浸泡種子過(guò)夜至胚根露白[13]。EMS溶液設(shè)置為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%等5個(gè)濃度，處理時(shí)間設(shè)置為4 h，8 h，12 h，16 h，共20個(gè)組合。EMS溶液浸泡亞麻種子，搖床120 r/min使種子與溶液充分接觸；待浸泡完成后使用1%的硫代硫酸鈉溶液浸泡種子0.5～1 h終止反應(yīng)，使用流水沖洗至EMS無(wú)殘留并立即播種，根據(jù)M1代半致死率確定EMS最佳誘變條件。統(tǒng)計(jì)M1代性狀表型，確定變異性狀，M2代單株留存種質(zhì)，建立亞麻突變體庫(kù)。

1.2.2M4代萌發(fā)期耐旱性評(píng)價(jià)

用15% PEG-6000處理大小一致、籽粒飽滿的突變體種子，蒸餾水作為對(duì)照。75%的乙醇消毒3 min，蒸餾水清洗3遍自然風(fēng)干后放入鋪有2張無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，每皿均勻分布30粒種子，分別加入10 mL溶液，24 ℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，每2 d補(bǔ)加1 mL溶液，保持水勢(shì)不變，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3M4代苗期耐旱性評(píng)價(jià)

選取籽粒飽滿突變體M4代種植于8 cm×8 cm育苗缽內(nèi)，生長(zhǎng)30 d后每個(gè)品種定苗30株，將1 L 18% PEG-6000澆灌到底部托盤(pán)模擬干旱環(huán)境，24 ℃連續(xù)處理7 d，每3 d復(fù)加1 L 18% PEG-6000，維持水勢(shì)不變，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4測(cè)量指標(biāo)

按株系詳細(xì)記錄種質(zhì)突變性狀，成熟期單株收獲突變體種質(zhì)，無(wú)明顯突變性狀種質(zhì)不保留。

EMS誘變成活率=成株數(shù)/處理的種子數(shù)[14]；

發(fā)芽率(%)=(7 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù))×100%；

●whether it gets warmer or not. If the answer is "yes", that means it is time to sow highland barley.

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(處理發(fā)芽率/對(duì)照發(fā)芽率)×100%；

相對(duì)芽長(zhǎng)(%) =(處理芽長(zhǎng)/對(duì)照芽長(zhǎng))×100%；

相對(duì)鮮重(%)=(處理鮮重/對(duì)照鮮重)×100%；

相對(duì)株高(%)=(處理株高/對(duì)照株高)×100%；

相對(duì)根長(zhǎng)(%)=(處理根長(zhǎng)/對(duì)照根長(zhǎng))×100%。

1.2.5抗旱性綜合評(píng)價(jià)

式中Xi、Ximin、Ximax分別表示第i個(gè)指標(biāo)測(cè)定值，第i個(gè)指標(biāo)最大值和最小值。最后求和各性狀隸屬函數(shù)值：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析，顯著性檢驗(yàn)采用Excel軟件，SPSS(25.0)，R，軟件完成；根長(zhǎng)等測(cè)量通過(guò)Image J和Prism 5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻種子EMS誘變參數(shù)確定

選用5個(gè)不同濃度(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)的EMS溶液和4個(gè)處理時(shí)間(4 h、8 h、12 h、16 h)，共20個(gè)組合處理已萌動(dòng)的“范尼”種子。根據(jù)成株率和發(fā)芽率數(shù)值，對(duì)不同組合EMS處理的誘變結(jié)果進(jìn)行研究。多重比較結(jié)果(表1)表明，隨著處理濃度和時(shí)間增加，成株率均逐漸降低；處理時(shí)間和濃度組合與成株率之間具有顯著差異；根據(jù)誘變半數(shù)致死率原則，亞麻EMS最佳誘變體系為EMS濃度0.6%、處理時(shí)間4 h和EMS濃度0.4%、處理8 h，在兩個(gè)處理組合下亞麻種子發(fā)芽率為55%和56%。

表1 不同處理時(shí)間和濃度下成株率的多重比較

2.2 亞麻突變體庫(kù)分析

2014年5月，采用EMS濃度0.6%，處理時(shí)間4 h，誘變5 000粒亞麻種子，露白播種。經(jīng)EMS誘變處理M1“范尼”成株率為26.09%。在全生育時(shí)期記錄M1代誘變性狀，主要分為葉色、葉形、莖稈顏色、莖稈類(lèi)型、株高、發(fā)育進(jìn)程、白化等27種突變類(lèi)型。為進(jìn)一步分析EMS誘變特征，2015年5月，播種單株收獲的269個(gè)具有表型變異的M1代，調(diào)查顯示(圖1)，269個(gè)突變株系中，共有55株穩(wěn)定遺傳，在M2代中發(fā)生表型突變率約為20.44%。根據(jù)EMS誘變成株率為26.09%，M1發(fā)生誘變率(5.38%)，M2代發(fā)生誘變率(1.1%)以及突變性狀可遺傳比率(20.44%)。

注：1為莖扁；2為頂端多分枝；3為葉枯萎；4為莖花斑；5為葉不展；6為白化；7為花序集中；8為葉黃；9為早熟。

表2 不同EMS濃度和處理時(shí)間下亞麻種子發(fā)芽率

2.3 7份M4代突變體抗旱性評(píng)價(jià)

EMS誘變株自交4代，獲得7個(gè)與抗旱相關(guān)的突變體材料進(jìn)行亞麻萌發(fā)期和苗期抗旱分析。

萌發(fā)期干旱脅迫結(jié)果表明，與野生型“范尼”相比，M4突變體各項(xiàng)生理指標(biāo)均發(fā)生顯著變化。其中M4-6-2在對(duì)照和處理?xiàng)l件下的萌發(fā)率為81%和75%，均顯著低于其他突變材料(p<0.01)；M4-5-5的萌發(fā)率在對(duì)照和處理之間下降明顯(p<0.01)(圖2)；各材料間耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值相對(duì)發(fā)芽率最大，相對(duì)鮮重與相對(duì)芽長(zhǎng)都較小；相對(duì)發(fā)芽率在種質(zhì)間差異最小，相對(duì)鮮重在種質(zhì)間差異最大(圖3)；供試亞麻的D值變化范圍為0.1～1，結(jié)果(圖4)顯示D值與相對(duì)鮮重，相對(duì)芽長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

注：小寫(xiě)英文字母顯示0.01水平顯著，C代表對(duì)照組(水處理)，D代表干旱處理(PEG-6000)。

圖3 亞麻M4代突變體材料萌發(fā)期耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值

圖4 萌發(fā)期耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值與D值的相關(guān)性分析

根據(jù)萌發(fā)期亞麻耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值，供試亞麻耐旱性分析如表3，抗旱隸屬函數(shù)在0.04～1之間。M4-12-1與野生型范尼無(wú)差異，M4-18-2表現(xiàn)出較原種質(zhì)相對(duì)耐旱，M4-6-2，M4-16-1在萌發(fā)期表現(xiàn)出對(duì)干旱極敏感性狀。

表3 亞麻M4代突變體萌發(fā)期抗旱隸屬函數(shù)值

苗期干旱脅迫結(jié)果顯示，干旱處理后亞麻各生理指標(biāo)均呈顯著差異；其中相對(duì)鮮重變異系數(shù)最大，相對(duì)株高，相對(duì)根長(zhǎng)都較小(圖5)； 相對(duì)鮮重，相對(duì)株高與D值呈顯著相關(guān)性(圖6)；D值變化范圍在0.13～1之間，隸屬函數(shù)分析顯示：M4-8-2苗期較“范尼”耐旱，M4-6-2,M4-16-1表現(xiàn)為干旱敏感表型，其余種質(zhì)為中等耐受(表4)。

表4 亞麻M4代突變體苗期抗旱隸屬函數(shù)值

圖5 亞麻M4代突變體苗期耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值

圖6 苗期耐旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值與D值的相關(guān)性分析

2.4 抗旱性綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)隸屬函數(shù)值對(duì)7份M4亞麻的抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)。萌發(fā)期亞麻抗旱品種等級(jí)排序：M4-18-2>M4-12-1>范尼>M4-5-5>M4-32-4>M4-8-2>M4-6-2>M4-16-1；苗期亞麻抗旱品種等級(jí)排序?yàn)椋篗4-8-2>“范尼”>M4-5-5>M4-32-4>M4-18-2>M4-12-1>M4-16-1>M4-6-2；萌發(fā)期，苗期耐旱篩選綜合比較發(fā)現(xiàn)，與“范尼”相比，M4-8-2和M4-18-2分別在萌發(fā)期和苗期較為耐旱，但兩品種在兩個(gè)時(shí)期并未發(fā)現(xiàn)一致性；M4-12-1萌發(fā)期與“范尼”表現(xiàn)為相同耐受水平，苗期弱于“范尼”抗旱水平；M4-5-5，M4-8-2和M4-32-4抗旱性在萌發(fā)期和苗期均弱于范尼，M4-6-2,M4-16-1在萌發(fā)期和苗期均表現(xiàn)為干旱敏感性。

3 討 論

3.1 亞麻種質(zhì)突變體庫(kù)構(gòu)建方法

由于EMS誘變方法簡(jiǎn)單，成功率高，已廣泛運(yùn)用于植株選育。目前已構(gòu)建突變體庫(kù)的植物包括擬南芥[15]、水稻[16]小麥[17]、大豆[18]、纖用亞麻[19]等，常見(jiàn)突變農(nóng)藝性狀包括高產(chǎn)[20]、早熟[21]、豐富葉型[22]、抗逆[23]等。

高濃度EMS處理誘變種質(zhì)會(huì)損傷植株，造成處理后的種質(zhì)發(fā)芽率降低、生長(zhǎng)停滯或死亡，不同試驗(yàn)組合之間誘變差異顯著，因此，最佳誘變條件選擇尤為重要[24]。研究表明，EMS處理濃度和時(shí)間分別在0.025%～0.75%和4～18 h范圍之間，不同處理方式之間差別極為顯著[26-27]。EMS誘變育種選育評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為后代半致死率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定EMS處理纖用亞麻“范尼”大田的處理濃度和處理時(shí)間組合為0.6%/4 h或0.4%/8 h。本實(shí)驗(yàn)田間共處理5 000粒亞麻種子，M1代具有突變性狀的僅有269株，田間工作量大，成株率低，最終突變體數(shù)量少，這與徐艷花[14]，張鳳方等[25]的研究結(jié)果一致。

3.2 突變體性狀分析

EMS誘變?yōu)閱螇A基變化，性狀豐富，但EMS誘變劑會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致M1代部分植株生長(zhǎng)受到影響。植物EMS誘變主要集中于莖、穗、產(chǎn)量和葉片等性狀[28]。通過(guò)對(duì)亞麻不同生育時(shí)期變異性狀統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)M1代變異性狀可遺傳至后代[19]，因此M1代突變性狀種類(lèi)成為突變體庫(kù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究中，根據(jù)EMS誘變的M1代成株率為26.09%，M1代發(fā)生誘變概率為5.38%，M2代發(fā)生誘變率為1.1%，由M1代至M2代穩(wěn)定遺傳率約為20.44%。EMS性狀可穩(wěn)定遺傳，桑賢春等[29]利用EMS誘變獲得矮化水稻突變體dbc 1，基因鑒定性狀受1對(duì)隱性基因調(diào)控，因此本實(shí)驗(yàn)獲得的突變體也可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 突變體對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)分析

水分是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的主要因素之一，通常種子萌發(fā)和苗期生長(zhǎng)階段對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)最為迅速，因此，抗逆實(shí)驗(yàn)主要集中于萌發(fā)期和苗期[9]。亞麻在出苗25 d左右進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，隨后莖中韌皮纖維生長(zhǎng)加厚，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)分化為開(kāi)花準(zhǔn)備，這一階段水分的利用對(duì)纖維品質(zhì)和種子產(chǎn)量非常重要[30]。前人研究認(rèn)為，亞麻抗旱性評(píng)價(jià)的指標(biāo)中，發(fā)芽率[4]，芽長(zhǎng)[31]，鮮重[30]權(quán)重貢獻(xiàn)較大，加權(quán)隸屬函數(shù)(D值)通過(guò)把各生理指標(biāo)耐旱系數(shù)轉(zhuǎn)化為[0，1]的度量值，可以綜合評(píng)價(jià)不同品種的耐旱性[10]。本研究中，萌發(fā)期和苗期干旱處理相對(duì)鮮重變異系數(shù)均為最大值，說(shuō)明相對(duì)鮮重與亞麻是否耐旱密切相關(guān)，相對(duì)鮮重與D值呈極顯著正相關(guān)，在萌發(fā)期和苗期均保持一致趨勢(shì)，這一結(jié)果與劉峰[32]等研究結(jié)果一致。

突變體材料M4-8-2和M4-18-2在萌發(fā)期和苗期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)差異較大，表明萌發(fā)期干旱和苗期干旱，亞麻應(yīng)對(duì)的機(jī)制可能并不相同，植物可能通過(guò)不同的策略完成對(duì)逆境的響應(yīng)，這種現(xiàn)象在擬南芥耐鹽實(shí)驗(yàn)中也有報(bào)道[33]。

4 結(jié) 論

EMS誘變亞麻“范尼”萌動(dòng)種子，在0.6%/4 h和0.4%/8 h均能達(dá)到半致死率，達(dá)到最優(yōu)突變效果。加權(quán)隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，突變體M4代M4-6-2,M4-16-1 均表現(xiàn)為干旱敏感性，M4-6-2在干旱脅迫下萌發(fā)率顯著下降。