基于光合和熒光參數(shù)探討不同水稻品種苗期耐寒性差異

程 露， 職銘陽， 吳 迪， 陸勁羽， 項 陽， 鄭曉明， 逄洪波

(1.沈陽師范大學生命科學學院， 遼寧 沈陽 110034；2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所， 北京 100081)

水稻是人類生活中必不可少的糧食作物之一，世界上超過50%的人口以水稻為食[1]。全球種植水稻的國家大多數(shù)都遭遇過嚴重的冷害問題[2-4]。我國平均每五年就有一次大規(guī)模的低溫，因冷害問題導致我國水稻年產量減少30億～50億kg[5]。近年來，由于全球變暖和溫室效應的不斷累積，導致極端惡劣天氣出現(xiàn)的次數(shù)和規(guī)模不斷增大，因低溫造成的糧食減產問題愈加嚴重，給我國的糧食安全、經濟發(fā)展和國計民生帶來許多不利影響。

有關水稻低溫冷害的研究已有不少報道，低溫脅迫會不可逆轉地破壞水稻的整個生理和代謝過程，不僅對水稻的外部形態(tài)(如發(fā)育速度緩慢；株高、葉面積、群體生產力下降；生殖器官受損、空秕率增多等)造成嚴重的影響[6-7]，同時也會引起一系列生理生化指標(如葉綠素含量下降；丙二醛含量增高；相對電導率、可溶性糖以及其他代謝物含量增高等)的變化[8-11]。

光合作用是評價植物生長質量的重要依據，葉綠素含量對作物的產量有著巨大的影響[12]，作物產量大約 95% 是由葉綠素含量決定的。葉綠體的結構受到冷害脅迫時極易被破壞，葉綠體蛋白變性、葉綠素合成量減少、葉片顏色褪綠、植株黃化、同時光合同化能力下降，植株生長遲緩，產量與質量下降[13]。光系統(tǒng)是植物低溫脅迫下首先受到傷害的組織，其中光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)在植物光合作用的光反應過程中發(fā)揮著巨大的作用，影響光合作用中電子傳遞和光能轉化效率[14-15]。低溫條件下，PSⅡ結構受損，光化學活性受抑制，光能轉化效率降低。葉綠素熒光參與光合作用中的各個過程，當光合作用中某一點發(fā)生變化時，葉綠素熒光則會發(fā)生改變，因此可以將葉綠素熒光作為探究植物光合作用的探針，并將葉綠素含量和葉綠素熒光參數(shù)的大小視為植物耐受逆境的生理指標[16]。葉綠素熒光參數(shù)主要包括：暗適應初始熒光F0、暗適應最大熒光Fm、暗適應最大可變熒光Fv、最大光化學效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/F0等。

培育耐寒品種是解決冷害問題最直接的手段。王晨光等[17]以黑龍江省監(jiān)獄局水稻所提供的3個水稻品種為材料，分析其葉綠素含量、根系活力等4個生理指標的變化，鑒定出1個耐寒性較強的品種；王蘭等[18]以葉綠素含量為評價指標，從84份水稻品種中初步篩選出13份苗期耐寒材料；周新橋等[7]以植株的外部形態(tài)和死亡率作為評價指標，從南方稻區(qū)初步篩選出的18份水稻品種中鑒定出6份耐寒性較強的材料；丁國華等[19]利用自然低溫脅迫鑒定了130份耐寒性較好的材料。

本研究以30個水稻品種作為研究對象，測定低溫脅迫前后及一段恢復期內的葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，進而對水稻種質資源的苗期耐寒性進行篩選和鑒定，以期為水稻抗寒品種選育及耐寒分子育種提供中間材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的30個水稻品種均由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供，具體品種信息詳見表1。

表1 用于本實驗水稻品種詳細信息

1.2 材料的處理

種子放于 50 ℃ 培養(yǎng)箱處理 72 h 打破休眠后，營養(yǎng)土中播種，置于培養(yǎng)室(30 ℃，光照12 h/黑暗12 h)生長至14 d三葉一心期后，放入人工氣候培養(yǎng)箱(15 ℃，光照12 h/黑暗12 h)48 h后，放回培養(yǎng)室恢復生長。

1.3 生理指標的測定

實驗共選取處理前(T1)、15 ℃ 脅迫2 d(T2)、培養(yǎng)室恢復生長1 d(T3)、恢復生長3 d(T4)和恢復生長5 d(T5)這5個時間點進行葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的測定，每個指標重復測定3次。

1.3.1葉綠素含量的測定

采用 SPAD-502 Plus 葉綠素儀(浙江托普儀器公司)進行測定。

1.3.2光合指標的測定

采用pocket PEA 便攜式熒光儀(英國Hansatech公司)進行測定。

1.4 數(shù)據處理

使用Excel 2013軟件計算其平均值和標準方差。利用基迪奧平臺(http://www.omicshare.com/tools)，采用STEM軟件的原理，繪制箱線圖及趨勢分析圖。直接采用數(shù)據標準化處理后的值(T1～T1，T2～T1，T3～T1…)做趨勢分析，顯著性設置為默認值(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同水稻品種在低溫脅迫下葉綠素含量的變化

為了觀察不同水稻品種在低溫脅迫條件下葉綠素含量的變化，試驗對5個時間點的葉綠素含量進行了分析，結果如圖1所示，低溫脅迫前，粳稻葉綠素含量普遍高于秈稻；粳稻在受低溫脅迫時，葉片葉綠素含量雖然出現(xiàn)小幅下降，但在恢復生長后出現(xiàn)回升，走勢相對平穩(wěn)，說明粳稻在受低溫脅迫時恢復力較好；而秈稻在受低溫脅迫時，葉綠素含量呈明顯的下降趨勢。整體上，秈稻的葉綠素含量變化受低溫影響較大，說明粳稻的耐寒能力強于秈稻。

圖1 低溫處理前后粳稻與秈稻葉綠素含量箱線圖

為了進一步觀察粳稻各個品種間的差異，試驗對16個粳稻品種5個時間點的葉綠素含量變化進行了趨勢分析(圖2)。從圖2可以看出，粳稻葉綠素含量變化的趨勢分為3種。A趨勢4個品種(z 973、z 1076、z 1114和z 1094)的葉綠素含量在低溫脅迫前后5個時間點內一直呈現(xiàn)下降趨勢，下降值高達4，相較于未處理前存在顯著差異(p<0.05)，說明這4個粳稻品種耐寒性較差。B趨勢的6個品種(z 947、z 955、z 969、z 1034、z 1083和z 1107)在低溫脅迫2 d及恢復生長1 d內，葉綠素含量下降幅度較小，相較于未處理前不存在顯著差異；恢復生長3 d后，不同品種葉綠素含量回升的幅度不一樣，說明各品種耐寒性存在差異；恢復生長5 d 后，B趨勢的6個品種的葉綠素含量恢復到未處理前水平。C趨勢包含6個品種，分別為z 931、z 976、z 984、z 1001、z 1049 和z 1080，其在低溫脅迫2 d內，葉綠素含量下降較??；恢復生長1 d內葉綠素含量無明顯變化；恢復生長3 d內，葉綠素含量出現(xiàn)不同程度的回升；恢復生長5 d后，葉綠素含量出現(xiàn)小范圍下降。從葉綠素含量變化趨勢可以初步篩選出粳稻中除了A趨勢4個品種外，其余品種的耐寒性相對較好。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

與粳稻相比，14個秈稻品種在低溫脅迫前后5個時間點其葉綠素含量變化趨勢相對比較簡單，只有兩個趨勢(圖3)。A趨勢包含了13個品種，分別為z 930、z 939、z 940、z 945、z 953、z 992、z 1020、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118，其葉綠素含量在低溫處理前后5個時間點一直在大幅下降，且相較于未處理前存在顯著差異，說明絕大部分秈稻品種對低溫敏感，耐寒性較差。B趨勢僅包含z 1082一個品種，其葉綠素含量在低溫脅迫2 d內，下降幅度較少；并且在恢復生長3 d內，葉綠素含量出現(xiàn)回升；恢復生長5 d后，雖然葉綠素含量出現(xiàn)小幅下降，但較未處理前下降較小，說明該秈稻品種較絕大多數(shù)秈稻而言，為較好的耐寒品種?？傮w上看，葉綠素含量變化范圍較大，呈明顯的下降趨勢；但個別品種(B趨勢品種)的葉綠素含量較未處理前差異較小，為較好的耐寒品種。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

2.2 低溫處理對不同水稻品種Fv/Fm 值的影響

圖4是30個水稻品種的PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)結果，從圖4可以看出，不同水稻品種其幼苗葉片間的Fv/Fm值在未受到低溫傷害前不存在顯著差異，均在0.80～0.82之間。15 ℃放置2 d后，粳稻與秈稻品種Fv/Fm值均出現(xiàn)降低現(xiàn)象，每個品種下降的程度各不相同，總體上看秈稻下降幅度更大?；謴蜕L后，粳稻與秈稻的Fv/Fm值均表現(xiàn)出不同幅度的上升現(xiàn)象，且粳稻恢復水平更快。由于各水稻品種在低溫處理前后其Fv/Fm值保持在0.75～0.83之間，相差很小，無法很好地反映出其顯著變化趨勢，故不做分析。

圖4 低溫處理前后粳稻與秈稻Fv/Fm值箱線圖

2.3 低溫處理對不同水稻品種Fv/F0值的影響

圖5是30個水稻品種的Fv/F0值在低溫脅迫前后5個時間點的測定結果。未受到低溫傷害前，各品種的Fv/F0值均保持在0.40～0.45之間，無顯著差異。低溫處理2 d后，粳稻與秈稻的Fv/F0值均出現(xiàn)下降現(xiàn)象，總體上秈稻下降幅度較大?；謴蜕L一段時間后，粳稻與秈稻的Fv/F0值均表現(xiàn)出不同程度的回升現(xiàn)象，且粳稻回升更快，說明粳稻恢復力更強。

圖5 低溫處理前后粳稻與秈稻Fv/F0值箱線圖

為了進一步觀察粳稻各個品種間的差異，對16個粳稻品種5個時間點的Fv/F0值進行了趨勢分析，變化趨勢大致分為4種(見圖6)。A趨勢僅包含z 1094一個品種，其Fv/F0值在低溫脅迫后一直呈現(xiàn)下降趨勢，且恢復5 d后其Fv/F0值相較于處理前存在顯著差異，說明該粳稻品種受溫度影響較大，耐寒性較差，為冷敏感型品種。B趨勢2個品種(z 969和z 984)在低溫脅迫至恢復1 d內，F(xiàn)v/F0值出現(xiàn)小范圍的下降后；恢復生長1 d后，出現(xiàn)不同程度的回升現(xiàn)象，特別是最初下降幅度大的品種，其漲幅迅速，說明受傷害后恢復較好?；謴蜕L5 d后，基本恢復到進行低溫脅迫前的水平，說明植株已經恢復正常生長。C趨勢2個品種(z 1034和z 1107)的Fv/F0值，在低溫處理2 d后下降范圍較小，與處理前不存在顯著差異?；謴蜕L1 d后，出現(xiàn)不同程度短暫上升的現(xiàn)象?；謴蜕L3 d后，其Fv/Fm值均再次出現(xiàn)下降趨勢，范圍較小?；謴蜕L5 d后，其Fv/Fm值較未處理前差異不顯著。D趨勢包含11個品種，分別為z 931、z 947、z 955、z 973、z 976、z 1001、z 1049、z 1076、z 1080、z 1083和z 1114，呈W狀走勢，即在低溫處理2 d內，其Fv/Fm值下降范圍較小，且在恢復生長1 d內均出現(xiàn)不同程度的短暫回升現(xiàn)象；雖然恢復生長3 d內均再次出現(xiàn)短暫小幅下降，但恢復生長5 d后其比值與未處理前無明顯差異，甚至個別品種其比值高于對照。通過低溫前后各品種Fv/F0值變化的趨勢圖，初步得出粳稻中除了A趨勢1個品種外，其余品種耐寒性較好。且Fv/Fm值的變化趨勢與葉綠素含量的變化基本一致。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

進一步對14個秈稻品種在低溫脅迫前后5個時間點的Fv/F0值變化進行趨勢分析(圖7)。A趨勢僅有z 1020 一個品種的Fv/F0值在低溫處理前后5個時間點內一直大幅下降，極值達到4，說明該秈稻品種極易受溫度的影響，為極不耐寒品種。B趨勢含有1個品種(z 1082)，盡管在低溫脅迫至恢復1 d內，F(xiàn)v/F0值顯著下降，但在恢復生長1 d后迅速上升，且恢復生長5 d后其Fv/F0值恢復至對照水平，說明該品種低溫脅迫后恢復速度快，相較于絕大多數(shù)秈稻而言，為較好的耐寒品種。C趨勢z 940在低溫脅迫2 d內，F(xiàn)v/F0值大幅下降，雖然恢復生長1 d后，出現(xiàn)短暫回升現(xiàn)象，但在恢復生長5 d后，其Fv/F0值相較于未處理前仍存在顯著差異，為不耐寒品種。D趨勢的11個品種(z 930、z 939、z 945、z 953、z 992、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118)整體呈W走勢，即低溫處理2 d內，F(xiàn)v/F0值下降程度較大，最大下降1.5；恢復生長1 d內，F(xiàn)v/F0值均出現(xiàn)短暫上升現(xiàn)象，上升的幅度各不相同；恢復生長3 d內，再次出現(xiàn)短暫下降，恢復生長5 d后，絕大多數(shù)品種的Fv/F0值仍低于冷處理前，說明恢復速度慢，耐寒性較差。通過低溫前后各品種Fv/F0值變化的趨勢圖，可以得出秈稻中除了B趨勢1個品種外，其余品種耐寒性較差。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

3 討 論

目前，有關水稻苗期耐寒性篩選鑒定的研究主要根據外部形態(tài)特征以及生理生化指標兩方面開展[7]。光合作用是植物維持機體正常生命活動的必要生物過程，通過植物光合作用強弱可以判斷其生長的好壞。葉綠素在光吸收中發(fā)揮著巨大的作用，葉綠素的含量直接影響了植株的光合效率和產量[12]。在一定范圍內，植物體葉綠素含量越高，生物學產量越高[18]。當植物受到冷害脅迫時，葉綠體結構受破壞，葉綠素合成降低，光合作用受抑制，進而導致光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活動受抑制，可能是光合作用的降低引起PSⅡ的潛在活性Fv/F0的下降，抑制了原初光能反應過程，使得PSⅡ無法正常傳遞電子，導致最大光化學效率Fv/Fm的下降。王國莉等[20]以光合速率和葉綠素熒光參數(shù)為評價指標，比較低溫對水稻耐冷品種和冷敏感品種二者之間的影響。本研究以葉綠素含量以及熒光參數(shù)Fv/Fm值和Fv/F0值作為水稻苗期耐寒性的鑒定評價指標，研究結果表明，不同品種的水稻幼苗在低溫脅迫條件下，其葉綠素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值下降程度呈現(xiàn)出明顯的差別，葉綠素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值的下降程度均與水稻品種的耐寒性呈明顯的反比關系；隨著溫度恢復升高，三者均出現(xiàn)不同程度的回升現(xiàn)象。因此，葉綠素含量以及熒光參數(shù)Fv/Fm值和Fv/F0值可以作為低溫脅迫條件鑒定水稻苗期耐寒性的生理指標。

以往的研究結果表明，栽培稻的兩個亞種在漫長的人工馴化和進化過程中逐漸適應各自的生存環(huán)境，粳稻生長在溫帶及低緯度地區(qū)，秈稻生長在熱帶及亞熱帶地區(qū)，故粳稻的耐寒性普遍強于秈稻[21-22]。本研究測定了30個水稻品種低溫前后的葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，結果顯示粳稻的耐寒性普遍強于秈稻，與前人的結果相一致。同時發(fā)現(xiàn)粳稻個別品種，如z 973、z 1076、z 1094和z 1114在受低溫脅迫時，葉綠素含量下降量較大，甚至在恢復生長后葉綠素含量較未處理前仍存在較大差異，說明粳稻中也存在低溫敏感品種。而秈稻品種如z 1082在受到冷害時，葉綠素含量下降程度較小，能夠正常合成葉綠素，屬于較好的耐寒品種。南方水稻種植區(qū)為了提高種植產量，經常會選擇一些苗期耐寒性強的早秈稻，故水稻品種的耐寒性不僅由遺傳背景決定，還與其地理分布及當?shù)氐姆N植策略相關。本研究根據低溫脅迫下葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，初步篩選出苗期耐寒性較強的水稻種質資源13份，分別為黑龍江省的z 976、z 984、z 1034、z 1080和z 1001，遼寧省的z 969和z 1107，吉林省的z 931和z 944，云南省的z 1083，北京市的z 947，廣東省的z 1082及日本的z 1049。

綜上所述，本研究通過生理指標對30個水稻品種的苗期耐寒性進行鑒定評價。結果表明，低溫影響水稻生長發(fā)育中葉綠素的合成，且對不同水稻品種的影響程度不一，總體上粳稻耐寒性好于秈稻。本研究以葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值可以很好的區(qū)分各個品種的苗期耐寒性，并初步篩選出苗期耐寒性較強的水稻種質資源13份，研究結果對耐寒水稻種質的選育及耐寒后續(xù)基因挖掘及功能驗證具有一定的參考意義。