酶解預處理工藝在煙葉茄尼醇提取中的應用

黃振瑞 柳穎 黎志德

摘 ?要：為提高煙葉中茄尼醇的提取率，通過纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用的方法對煙葉進行預處理，研究了酶種類、添加量、溫度、pH和反應時間對煙葉提取液中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的影響，并以Box-Behnken響應面法優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果表明，在單因素試驗中，最優(yōu)工藝為纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用（酶添加量為每克煙葉各1.00 U）、溫度55 ℃、pH 5.2和反應時間60 min;與未經(jīng)酶解預處理的空白組（CK）相比，纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用處理后，游離和總茄尼醇提取率分別增加305.61%和113.55%，響應面法優(yōu)化后，總茄尼醇提取率較CK提高158.78%。本研究探索出一種提高茄尼醇提取率的有效方法，對煙草綜合利用具有指導意義。

關鍵詞：煙葉;茄尼醇;酶解;響應面法

Abstract： In this study， both cellulase and hemicellulose were used in pretreatment process in order to improve the extraction rate of solanesol in tobacco leaves. The effects of enzyme types， dosage， temperature， pH and reaction time on the content of free solanesol and total solanesol in tobacco leaf extracts were studied. Optimization of enzymatic hydrolysis was carried out by the Box-Behnken response surface method. The results of single-factor experiment showed that the optimal enzymatic hydrolysis process was cellulase-hemicellulase combined use （1.00 U per gram of tobacco leaves）， temperature 55 ℃， pH 5.2 and reaction time 60 min; Compared with the control group without enzymatic hydrolysis pretreatment， the extraction rate of free solanesol of the cellulase-hemicellulase combined use group was increased by 305.61% and the total solanesol was increased by 113.55%. After response surface optimization， the total solanesol extraction rate was increased by 158.78% compared with the control group. This study has explored an effective way to improve the extraction rate of solanesol in tobacco leaves， which has guiding significance for the comprehensive utilization of tobacco.

Keywords： tobacco leaf; solanesol; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

茄尼醇（Solanesol）是一種不飽和的聚異戊二烯醇，屬四倍半萜醇和長鏈脂肪醇[1]，具有抗菌、消炎和止血作用，同時也是許多藥物的重要中間體，可用于合成N-茄尼基谷酰氨、輔酶Q10[2]和維生素K2[3]等，廣泛存在于煙草、馬鈴薯和桑樹等植物中，以煙草中的含量最為突出，最高可達3%[4]。其在煙草中以游離態(tài)或化合態(tài)形式存在，新鮮煙葉中通常以化合態(tài)為主，隨著貯存時間的延長逐漸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[5]。茄尼醇易溶于正己烷等有機溶劑，微溶于乙醇[6]，在光照、加熱環(huán)境中易發(fā)生衰變[7]。目前茄尼醇的提取方式以有機溶劑（如正己烷、乙醇）提取為主，存在提取時間長、溶劑使用量大，易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象導致難以分層等問題[8]。其他提取方法如超臨界二氧化碳萃取、分子蒸餾和微波輔助萃取等，存在前期設備投入大，工藝復雜不利于擴大等問題，在實際生產(chǎn)中鮮有應用[9]。

植物細胞壁主要包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和少量果膠，使用相應水解酶可破壞細胞壁，促進組織內(nèi)物質(zhì)釋放，從而提高提取效率。酶解處理具有反應條件溫和、試劑用量少和綠色環(huán)保高效等優(yōu)點[10]，已被廣泛應用于活性天然產(chǎn)物的提取工藝中，如酶解輔助提取白藜蘆醇[11]和羥基酪醇[12]等。以纖維素酶為主的復合酶制劑被報道用于提高煙葉中茄尼醇[13]、煙堿[14]、綠原酸[15]和香氣物質(zhì)[16]的提取率，但以上研究仍存在提取時間長、酶添加量大等不足。造成以上問題的原因可能是，半纖維素與木質(zhì)素相互交聯(lián)覆蓋于纖維素表面形成致密保護層，阻礙了酶對纖維素的可及性，而采用相應酶水解半纖維素和木質(zhì)素有助于全面破壞植物細胞壁[17-18]，提升天然產(chǎn)物提取率。有文獻以纖維素酶-木質(zhì)素酶復合預處理提升煙葉中茄尼醇提取率[13]，尚未見在煙葉中使用半纖維素酶及纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用預處理輔助提取茄尼醇的報道。本試驗在正己烷超聲提取茄尼醇的基礎上，探索以較低量添加纖維素酶和半纖維素酶對煙葉進行預處理來提升茄尼醇提取率、縮短萃取時間，為煙葉資源綜合利用提供經(jīng)濟便捷的新方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?主要材料與儀器

煙葉由廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所廣東省煙草育種與綜合利用工程技術研究中心提供。

試劑：纖維素酶40 000 U/g、半纖維素酶20 000 U/g（上海源葉生物科技有限公司），正己烷、無水乙醇（AR，上海麥克林生化科技有限公司）;甲醇、異丙醇[色譜純，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]，冰乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀（AR，國藥集團化學試劑有限公司）。

纖維素酶活力單位：1 h水解底物（濾紙、CMC、脫脂棉或水楊素）產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位U。

半纖維素酶活力單位：1 min內(nèi)從半纖維素產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位U。

儀器：Q-Grad型四元高壓混合梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、605型柱溫箱（美國SSI公司）;檢測器，Lab Alliance CS4000 Model 201;色譜柱，Apollo C18 5u反相分離柱（美國Grace公司）;超聲振蕩器JH-1001（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 ?提取工藝

1.2.1 ?煙葉前處理 ?將約1.5 kg煙葉置于烘箱中55 ℃烘至恒重，碾碎后混合均勻，置于防潮箱中備用。每試驗組取樣3次，每次取1 g煙葉;每個樣品平行測定3次。

1.2.2 ?酶解輔助提取煙葉茄尼醇工藝流程 ?經(jīng)前處理的煙葉→緩沖液浸泡預熱→加入酶制劑（空白對照CK以滅活酶液代替）→渦旋振蕩→水浴→棄液烘干→超聲輔助正己烷萃取→離心→取上清→皂化→水洗→定容。

將煙葉按1∶10（m∶V）置于乙酸-乙酸鈉緩沖液中預熱15 min，加入經(jīng)適當稀釋的酶液振蕩搖勻，水浴保溫至預定時間，棄去液體部分，殘余煙葉55 ℃烘干待用。按1∶30（m∶V）向煙葉加入正己烷，45 ℃水浴中以1500 w功率超聲提取15 min，然后4000 r/min離心10 min，收集上清后分兩次向煙葉加入1∶10（m∶V）的正己烷重復上述步驟，合并上清，稀釋定容，分析游離茄尼醇的含量。空白對照（CK）烘干后，直接加入正己烷按上述步驟提取。

取4 mL定容后的提取液加入4 mL 0.02 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液，搖勻后加塞，并在60～65 ℃條件下振蕩皂化2 h，收集皂化液，加入適量正己烷補齊體積至4 mL，加入3 mL蒸餾水渦旋振蕩，稀釋定容，分析總茄尼醇的含量。

1.2.3 ?酶解工藝參數(shù)優(yōu)化試驗 ?分別以酶種類、添加量、溫度、pH和水解時間對煙葉提取液中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的影響進行單因素試驗。

酶種類與添加量的影響：纖維素酶和半纖維素酶每克煙葉添加量為0.25、0.50、1.00、2.50和5.00 U，其中pH及溫度條件按酶活最適條件設定（纖維素酶pH 4.8[19]，半纖維素酶pH 5.6[20]）溫度45 ℃下反應1 h，未加酶處理的空白組為對照（CK）。

溫度的影響：溫度為25、35、45、55和65 ℃，酶添加量為纖維素酶和半纖維素酶各1.00 U，反應pH為4.8，反應時間1 h。

pH的影響：以乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制不同的pH體系，分別為4.0、4.4、4.8、5.2、5.6和6.0，酶添加量為每克煙草纖維素酶和半纖維素酶各1.00 U，反應溫度45 ℃，反應時間1 h。

時間的影響：選取不同的反應時間30、60、90和120 min，酶添加量為每克煙草纖維素酶和半纖維素酶各1.00 U，反應pH為4.8，反應溫度45 ℃。

基于上述單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert設計響應面優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，以反應溫度、pH和時間為自變量，以未經(jīng)酶解處理的空白組總茄尼醇提取量為對照，考察不同酶解工藝參數(shù)組合對茄尼醇提取率的影響。其中反應溫度為25～65 ℃，反應pH為4.0～6.0，反應時間為15～120 min。

1.2.4 ?茄尼醇的分析方法 ?采用GB/T 31758—2015《煙葉和煙葉提取物中茄尼醇的測定》中的方法對各樣本組游離茄尼醇與總茄尼醇含量進行分析。具體條件如下：流動相V甲醇∶V異丙醇=7∶3;柱溫40 ℃;檢測波長213 nm;流速1.3 mL/min，進樣體積20 μL。取適量的茄尼醇系列標準溶液及待上機試樣溶液，由保留時間進行定性，根據(jù)系列標準液的濃度及茄尼醇響應峰面積建立標準曲線。計算進樣液茄尼醇濃度后，根據(jù)待測液體積以及樣品稱樣量換算出煙葉樣品中茄尼醇含量。

1.2.5 ?數(shù)據(jù)處理 ?采用Design-Expert 12.0和Excel 2019 MSO進行試驗設計、數(shù)據(jù)分析和作圖，每個樣本重復3次，組間分析使用單因素方差分析（ANOVA）和Box-Behnken響應面法，結(jié)果采用平均值±偏差表示。

茄尼醇提取增長率：

X：樣本茄尼醇含量，mg/g;

T0：對照組茄尼醇含量，mg/g。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?酶添加量對提取液中茄尼醇含量的影響

由圖1、2可知，與CK相比，經(jīng)酶解預處理的各組提取液中游離與總茄尼醇含量均有所提高。由圖1可知，纖維素酶添加量為每克煙葉1.00 U時，提取液中游離茄尼醇與總茄尼醇含量均較CK增長明顯，而添加量在1.00～5.00 U時，提取液中總茄尼醇含量增長放緩至出現(xiàn)下滑。試驗中觀察到添加量為每克煙葉2.50 U及5.00 U的樣本，經(jīng)酶解預處理后煙葉質(zhì)量大幅下降，萃取液中出現(xiàn)大量渾濁物，兩相分層界面模糊，為控制加酶成本和確保后續(xù)工藝方便，纖維素酶添加量選擇為每克煙葉1.00 U。由圖2可知，半纖維素酶添加量每克煙葉1.00 U時提取液中總茄尼醇含量最高，添加量每克煙葉1.00～5.00 U時提取液中游離茄尼醇繼續(xù)升高，但總茄尼醇含量下滑趨勢明顯，推測是由于酶解程度過大導致總茄尼醇在預處理階段流失，因此半纖維素酶添加量選擇為每克煙葉1.00 U。

2.2 ?溫度對提取液中茄尼醇含量的影響

由圖3可知，提取液中游離茄尼醇含量受溫度影響較小，但酶處理組均高于CK。提取液中總茄尼醇含量受溫度影響較大，45～55 ℃總茄尼醇含量最高，當溫度升至65 ℃，提取液中總茄尼醇含量明顯下降。為保證茄尼醇穩(wěn)定并控制能耗成本，酶解溫度選擇55 ℃。

2.3 ?pH對提取液中茄尼醇含量的影響

由圖4可知，pH低于4.8時提取液中游離及總茄尼醇含量與CK相當，pH在4.8～5.6時提取液中游離及總茄尼醇含量較CK有明顯提高，其中pH為4.8和5.2兩組樣本含量最高且接近。當pH升至6.0時，提取液中茄尼醇含量下降到CK水平，因此酶解pH選擇為5.2。

2.4 ?酶解時間對提取液中茄尼醇含量的影響

由圖5可知，各組提取液中游離和總茄尼醇含量均高于CK。酶解時間30～60 min時，游離和總茄尼醇提取量隨時間延長而上升，60 min后，隨酶解時間延長游離和總茄尼醇提取率逐漸下降。因此，酶解時間選擇60 min。

2.5 ?單因素試驗結(jié)果驗證

以反應溫度55 ℃、pH 5.2和反應60 min為最優(yōu)參數(shù)，煙葉提取液中的茄尼醇含量見表1。由表1可知，單一纖維素酶、單一半纖維素酶、雙酶聯(lián)用酶解處理與CK相比，提取液中游離茄尼醇的含量分別提高了158.05%、197.80%和305.61%，總茄尼醇含量提高了78.29%、71.95%和113.55%。雙酶處理游離茄尼醇較單一酶處理提高36.20%～57.18%，總茄尼醇提高19.78%～24.20%。因此，優(yōu)選雙酶聯(lián)用進行酶解預處理。

2.6 ?基于Box-Behnken響應面法優(yōu)化酶解預處理工藝

每組分別按每克煙葉1.00 U添加纖維素和半纖維素酶，由Design-Export調(diào)整反應溫度、pH和時間3個參數(shù)組合生成17個試驗組，考察各組扣除空白對照的總茄尼醇提取增長率，擬合方程為：

Y=1.463 69?0.0446 327A?0.167 564B+0.042 855 3C+0.340 852AB+0.383 681AC+0.584 477BC?0.411 444A2?0.515 03B2?0.754 646C2

響應面試驗設計和結(jié)果見表2。由表2可知，組別13、16、17提取增長率為負值，說明該項工藝參數(shù)提取率較不作酶處理的空白對照1差，組別2工藝參數(shù)為45 ℃、pH 5.2和60 min的試驗組增長率最高為158.60%。

響應面擬合回歸方程的方差分析見表3。由表3可知方差分析模型的p-value<0.05，擬合精度好，可利用該響應面近似模型進行后續(xù)優(yōu)化設計。3個自變量相互作用顯著（p<0.05），同時失擬誤差不顯著，說明模型與真實值具有較好的擬合[21]。

酶解參數(shù)互作對茄尼醇萃取效率的影響見圖6。由圖6可知，3個圖譜均呈現(xiàn)出同心橢圓形，說明兩兩參數(shù)間交互作用明顯。在45～50 ℃和pH 4.6～5.0;pH 4.4～5.2和40～65 min以及35～55 ℃和40～50 min三組區(qū)間內(nèi)茄尼醇提取率都處于高水平，3個自變量的變化趨勢與單因素試驗中較吻合。通過響應面三維立體圖通過軟件對模型極值進行推算，酶解工藝在溫度45 ℃，pH 4.8下酶解反應51 min后進行提取可獲得最高的茄尼醇提取率，最終實際驗證該條件下提取茄尼醇增長率158.78%。

3 ?討 ?論

本研究通過單因素試驗及響應曲面法優(yōu)化了酶解預處理輔助提取煙葉中茄尼醇的工藝參數(shù)，采用纖維素酶與半纖維素酶水解細胞壁，促進茄尼醇溶出。酶添加量增加可促進酶蛋白與煙葉有效接觸，使水解反應速度加快，延長酶解時間可以促使煙葉細胞內(nèi)含物充分釋放;但是，酶解程度過大時會導致茄尼醇過早析出，造成后續(xù)提取量下降。酶蛋白對溫度和pH敏感，在其最適溫度（45 ℃）和pH條件（纖維素酶pH 4.8，半纖維素酶pH 5.6）下酶活力最高，結(jié)合相應萃取工藝可得到最優(yōu)的茄尼醇提取量。在單因素實驗優(yōu)化的最佳條件（反應溫度55 ℃、pH 5.2和反應60 min）下，纖維素酶、半纖維素酶單獨使用以及纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用時，提取液中茄尼醇含量均有大幅提高，說明酶解預處理能有效提高煙葉中茄尼醇的提取率;纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用與使用單酶處理相比，茄尼醇提取率分別提高36.20%～57.18%（游離茄尼醇）和19.78%～24.20%（總茄尼醇），說明雙酶聯(lián)用能進一步提高對煙葉中茄尼醇的提取率。

本研究確定的最佳預處理工藝，每克煙葉按纖維素酶-半纖維素酶1∶1各添加1.00 U，在45 ℃，pH 4.8酶解51 min，與王星敏等[13]按纖維素酶∶木質(zhì)素酶15∶1，每克煙葉共添加175 U并酶解8 h的處理工藝相比，大幅減少酶添加量，縮短酶解預處理時間。另外，本研究通過3次共45 min即完成有機溶劑提取步驟，與GB/T—31758中要求的12 h及其他工藝方法[7，9，13]要求的單次1～2 h并重復多次相比，溶劑提取時間縮短，生產(chǎn)效率提升。該工藝尚待研究改進的地方在于：（1）酶解處理后煙葉需充分烘干才可進行正己烷提取;（2）煙葉酶解處理后重量明顯下降，為減少有機溶劑用量創(chuàng)造可能，但煙葉的減重幅度與酶的添加量、反應條件等的對應關系有待研究;（3）不同品種煙葉的茄尼醇含量[22]和細胞壁纖維素、半纖維素、木質(zhì)素比例有所不同[23]，下一步需結(jié)合具體的生產(chǎn)條件，對該工藝進行細化研究。

4 ?結(jié) ?論

本研究建立了一種酶解預處理輔助提取煙葉中茄尼醇的工藝，通過纖維素酶-半纖維素酶聯(lián)用預處理，顯著提升了煙葉提取液中茄尼醇的含量。本方法操作簡單，酶添加量小，酶解及溶劑提取時間大幅縮短，對煙草資源的綜合利用具有一定指導意義。

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