雙向等位基因特異性PCR技術(shù)在煙草SNP分型中的應(yīng)用

林世鋒 王仁剛 潘飛 王自力 元野 李尊強(qiáng) 任學(xué)良 龍明錦 張吉順 曾吉凡 史躍偉

摘 ?要：為提高抗PVY煙草品種的分子育種效率，本研究針對(duì)抗病種質(zhì)資源半坤村曬煙中隱性抗病基因eIF4E1的SNP位點(diǎn)G149C建立一種簡(jiǎn)單快速的雙向等位基因特異性PCR（Bi-directional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的特異性、準(zhǔn)確度及實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，建立的Bi-PASA檢測(cè)方法能夠在一個(gè)PCR反應(yīng)中有效區(qū)分eIF4E1基因G149C位點(diǎn)3種基因型：野生型GG、雜合突變型GC、純合突變型CC。利用Bi-PASA檢測(cè)方法可以對(duì)K326×半坤村曬煙F2分離群體的基因型進(jìn)行有效鑒別，且鑒定結(jié)果與普通的等位基因特異性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）以及直接測(cè)序法的鑒定結(jié)果一致。綜上所述，本研究建立的Bi-PASA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便，可更好地應(yīng)用于eIF4E1基因的分子標(biāo)記輔助育種。

關(guān)鍵詞：煙草;eIF4E1基因;雙向等位基因特異性PCR;SNP分型

Abstract： In order to improve the efficiency of molecular marker assisted breeding for PVY-resistant tobacco varieties， we dedicated to establish a simple and rapid bi-directional PCR amplification of specific alleles （Bi-PASA） method for detecting the single nucleotide polymorphism （SNP） G149C of the recessive PVY resistance gene eIF4E1 of the resistant germplasm Bankuncunshaiyan， and to verify the specificity， accuracy and practicality of the established detection method. It turned out that the established Bi-PASA detection method can effectively distinguish the three different genotypes for the G149C SNP of the eIF4E1 gene in a single PCR reaction： wildtype （GG）， heterozygous mutant （GC） and homozygous mutant （CC）. The genotypes of eIF4E1 in the F2 population derived from K326/Bankuncunshaiyan were successfully identified by the Bi-PASA method. In addition， the genotypes of the F2 population identified by the established Bi-PASA method were all the same with that identified by the conventional allele-specific PCR （AS-PCR） and direct sequencing， which suggested that the established Bi-PASA method is characterized by strong specificity， high accuracy and simple operation. Therefore， it can be better applied in the eIF4E1 gene marker assisted breeding.

Keywords： tobacco; eIF4E1; bi-directional PCR amplification of specific alleles; SNP genotyping

由馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）引起的煙草馬鈴薯Y病毒病是煙草生產(chǎn)中的嚴(yán)重病害之一[1]?？剐曰虻耐诰蚝屠檬强筆VY育種的基礎(chǔ)[2-3]。研究顯示，在栽培煙草中，真核翻譯起始因子4E1（eukaryotic translation initiation factor 4E1，elF4E1）基因?yàn)闊煵軵VY隱性抗病基因，即感PVY基因，該基因的缺失或突變使煙草獲得PVY抗性[4]。2020年，本課題組[5]對(duì)抗PVY煙草品種半坤村曬煙中的PVY抗性基因進(jìn)行等位性檢測(cè)，結(jié)果顯示半坤村曬煙的PVY抗性同樣由eIF4E1基因控制。進(jìn)一步序列分析表明，相較于感病品種，半坤村曬煙的eIF4E1基因編碼區(qū)存在一個(gè)單核甘酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，即第149位堿基由G突變?yōu)镃，屬于錯(cuò)義突變，編碼的氨基酸由色氨酸突變?yōu)榻z氨酸，進(jìn)而造成半坤村曬煙對(duì)PVY產(chǎn)生抗病性，該單堿基突變?yōu)檫M(jìn)行eIF4E1等位基因分型提供了依據(jù)。

SNP基因分型是進(jìn)行SNP分子標(biāo)記輔助選擇育種的首要條件[6]。目前，SNP基因分型的方法有基于PCR技術(shù)的傳統(tǒng)分型方法和基于大型儀器的高通量檢測(cè)方法[7]?；赑CR技術(shù)的傳統(tǒng)分型方法，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）、單核苷酸引物延伸法（single nucleotide primer extension，SNuPE）和等位基因特異性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）[7-8]。PCR-RFLP由于受限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的影響，其應(yīng)用具有很大的局限性;PCR-SSCP和SNuPE技術(shù)操作繁瑣且重復(fù)性差?；诖笮蛢x器的高通量檢測(cè)方法，如高分辨率熔解曲線分析（high resolution melt，HRM）、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和基因芯片等技術(shù)[9-10]，檢測(cè)效率高，但儀器設(shè)備昂貴、成本高、較難普及。相比之下，利用AS-PCR技術(shù)對(duì)SNP進(jìn)行分型快速、簡(jiǎn)便、成本低[8]。2020年，本課題組[11]針對(duì)半坤村曬煙eIF4E1基因SNP G149C位點(diǎn)建立起AS-PCR分子標(biāo)記檢測(cè)體系，利用該標(biāo)記對(duì)K326×半坤村曬煙F2代抗感分離群體進(jìn)行的基因分型結(jié)果與抗病表型鑒定結(jié)果完全一致，進(jìn)一步說明半坤村曬煙的PVY抗性是由eIF4E1基因所控制，同樣利用該標(biāo)記可以對(duì)PVY抗性供體親本回交轉(zhuǎn)育后代的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，但每個(gè)單株基因型的檢測(cè)需要進(jìn)行2個(gè)單一PCR擴(kuò)增，操作步驟較為復(fù)雜。

雙向等位基因特異性PCR（bi-directional PCR amplification of specific alleles， Bi-PASA）是在等位基因特異性PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種更為簡(jiǎn)捷的SNP分型方法，其依據(jù)的基本原理是：針對(duì)1個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)2條延伸方向相反的內(nèi)側(cè)引物和2條外側(cè)引物，用這4條引物在同一PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增，即通過1次PCR反應(yīng)即可檢測(cè)出已知突變位點(diǎn)的類型[12-13]。最近幾年，雙向等位基因特異性PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是動(dòng)植物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)越來越多地受到研究者的重視[14]，其中在與植物抗病性狀相關(guān)SNP研究中，研究者分別建立了辣椒[15]、水稻[16]、苦瓜[17]等抗病基因的雙向等位基因特異性PCR檢測(cè)方法。但雙向等位基因特異性PCR要求在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)不同的基因類型進(jìn)行特異性擴(kuò)增，因而影響其擴(kuò)增效果的因素較多，對(duì)退火溫度差、引物配比、反應(yīng)溫度等參數(shù)均具有較高的要求[18]。

本文在半坤村曬煙eIF4E1基因序列分析檢測(cè)到SNP G149C位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，研究利用雙向等位基因特異性PCR技術(shù)進(jìn)行eIF4E1基因SNP分型，為煙草抗PVY育種SNP標(biāo)記的研究和應(yīng)用提供一種更加省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)有效的方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

本研究供試煙草材料均由貴州省煙草科學(xué)研究院新品種選育三組提供。以感PVY煙草品種K326、紅花大金元、云煙87作母本和抗PVY煙草品種半坤村曬煙作父本進(jìn)行雜交獲得各自F1代雜交種材料，其中K326×半坤村曬煙組合F1代再通過自交產(chǎn)生F2及回交世代，經(jīng)汁液摩擦接種法[19]進(jìn)行抗性鑒定后，用于標(biāo)記分析。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?煙草基因組DNA的提取 ?采用AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒（Axygen）提取煙草基因組DNA，并通過紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測(cè)基因組DNA的提取質(zhì)量。

1.2.2 ?雙向等位基因特異引物設(shè)計(jì) ?針對(duì)課題組先前在半坤村曬煙eIF4E1基因上發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)適合雙向等位基因特異性PCR擴(kuò)增的4條引物（圖1，表1）。設(shè)計(jì)方法如下：在SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，包括外引物2條，內(nèi)引物2條。先在SNP突變位點(diǎn)上下游200～500 bp處分別設(shè)計(jì)正、反向外引物（Outer primer），然后在所檢測(cè)的變異位點(diǎn)處設(shè)計(jì)2個(gè)包含變異堿基的正、反向內(nèi)引物（Inter primer），即2個(gè)內(nèi)引物的3′末端堿基分別與SNP位點(diǎn)的1個(gè)堿基相同（或互補(bǔ)），同時(shí)還在內(nèi)引物的3′末端倒數(shù)第2位（-2位）或第3位（-3位）人為引入了1個(gè)錯(cuò)配堿基（表1引物序列中小寫字母是特別設(shè)計(jì)的錯(cuò)配堿基）以提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。將4個(gè)引物鏈組成的3對(duì)引物在1個(gè)PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)2條帶的是純合型（GG或CC），出現(xiàn)3條帶的是雜合型（GC），如圖1所示。

1.2.3 ?雙向等位基因特異性PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) ?雙向等位基因特異性PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括Primix Taq酶（TaKaRa公司）10 μL，正、反向內(nèi)、外引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30個(gè)循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed核酸染料）上電泳，自動(dòng)凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照測(cè)序。

1.2.4 ?F2單株的基因型鑒定及測(cè)序驗(yàn)證 ?分別使用Bi-PASA及普通的AS-PCR方法[5]（引物序列見表1）對(duì)F2分離群體22個(gè)單株進(jìn)行鑒定分型;同時(shí)，以22個(gè)單株的DNA為模板，使用Bi-PASA外側(cè)引物P和Q進(jìn)行PCR擴(kuò)增（退火溫度55 ℃），然后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，驗(yàn)證Bi-PASA分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.5 ?Bi-PASA分子標(biāo)記在煙草種質(zhì)資源中的有效性檢測(cè) ?選取24個(gè)已知抗性的煙草品種（表2）制備基因組DNA（方法同1.2.1）;采用構(gòu)建的Bi-PASA分子標(biāo)記體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增（方法同1.2.3）;取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed核酸染料）上電泳，自動(dòng)凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草eIF4E1基因Bi-PASA遺傳標(biāo)記的建立

引物設(shè)計(jì)是Bi-PASA分子標(biāo)記成功的關(guān)鍵，根據(jù)Bi-PASA引物設(shè)計(jì)的基本原則，對(duì)煙草eIF4E1基因的SNP突變位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出45組Bi-PASA引物，經(jīng)PCR驗(yàn)證篩選出1組引物擴(kuò)增效果最好，特異性條帶最清晰、明亮，擴(kuò)增產(chǎn)物含量最高（資料未列出）。從圖2a可以看出，P/B引物對(duì)在突變純合型個(gè)體（半坤村曬煙）和突變雜合型個(gè)體（K326×半坤村曬煙、紅花大金元×半坤村曬煙、云煙87×半坤村曬煙）中擴(kuò)增出1條441 bp的電泳條帶，在野生純合型個(gè)體（K326、紅花大金元、云煙87）中沒有擴(kuò)增出電泳條帶。從圖2b可以看出，A/Q引物對(duì)在突變純合型個(gè)體中沒有擴(kuò)增出電泳條帶，在突變雜合型個(gè)體和野生純合型個(gè)體中擴(kuò)增出1條337 bp的電泳條帶。圖2c為加入A/Q/P/B引物組合的Bi-PASA遺傳標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，在突變純合型個(gè)體中擴(kuò)增出441 bp和726 bp兩條電泳條帶，顯示標(biāo)記個(gè)體基因型為CC型;在突變雜合型個(gè)體中擴(kuò)增出337、441和726 bp 三條電泳條帶，顯示標(biāo)記個(gè)體基因型為GC型;在野生純合型個(gè)體中擴(kuò)增出1條337 bp的電泳條帶，顯示標(biāo)記個(gè)體基因型為GG型，由于外引物組合擴(kuò)增效率低（擴(kuò)增不平衡）使外引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶（726 bp）未顯示，但并不影響SNP分型檢測(cè)結(jié)果。

上述結(jié)果表明，單引物A/Q和P/B具有很好的特異性和穩(wěn)定性，雙重引物A/Q/P/B擴(kuò)增結(jié)果是單引物擴(kuò)增結(jié)果的疊加，且能通過1次PCR反應(yīng)和1次凝膠電泳，便能區(qū)分供試材料的3種基因型，因此成功建立了檢測(cè)煙草eIF4E1基因SNP位點(diǎn)基因型的Bi-PASA檢測(cè)方法。

2.2 ?F2群體的AS-PCR分型結(jié)果

分別使用一對(duì)等位基因特異性（allele-specific，AS）的正向引物（FW和Fm）與共用反向引物（RWm）對(duì)F2分離群體的22個(gè)隨機(jī)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳分析對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物來判斷eIF4E1基因型。結(jié)果如圖3所示，4、6、10、14、21具有單一的ASM-m標(biāo)記特異條帶，是突變純合型（CC）植株;3、7、11、16、17、18具有單一的ASM-W標(biāo)記特異條帶，是野生純合型（GG）植株;其余單株同時(shí)具有ASM-m和ASM-W標(biāo)記特異條帶，是突變雜合型（GC）植株。

2.3 ?F2群體的Bi-PASA分型結(jié)果

利用Bi-PASA方法對(duì)F2分離群體的22個(gè)隨機(jī)單株進(jìn)行分型，結(jié)果如圖4所示，1、2、5、8、9、12、13、15、19、20和22號(hào)單株擴(kuò)增出337 bp、441 bp和726 bp三條電泳條帶，為突變雜合型單株（GC）;4、6、10、14和21號(hào)單株擴(kuò)增出441 bp和726 bp兩條電泳條帶，為突變純合型單株（CC）;3、7、11、16、17和18號(hào)單株擴(kuò)增出1條337 bp的電泳條帶，為野生純合型單株（GG）。所有單株的等位基因特征條帶明亮、清晰，分型結(jié)果與AS-PCR法的結(jié)果一致，說明所建立的Bi-PASA方法完

全可以取代AS-PCR法，用于eIF4E1基因G149C多態(tài)性位點(diǎn)的分型檢測(cè)。

2.4 ?測(cè)序結(jié)果

為了驗(yàn)證Bi-PASA分子標(biāo)記檢測(cè)到的F2代煙株基因型的正確性，對(duì)22個(gè)Bi-PASA分型單株進(jìn)行測(cè)序，利用Chromas 2.3查看測(cè)序結(jié)果。測(cè)序結(jié)果表明（圖5），Bi-PASA分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的一致性達(dá)到100%，說明Bi-PASA方法準(zhǔn)確、可靠。

2.5 ?Bi-PASA分子標(biāo)記在煙草種質(zhì)資源中的有效性檢測(cè)

利用Bi-PASA分子標(biāo)記引物組合對(duì)24個(gè)煙草品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖6），在17個(gè)PVY感病品種中擴(kuò)增出337 bp特異條帶，而在半坤村曬煙中擴(kuò)增出441 bp特異條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。除半坤村曬煙外，在其他PVY抗病品種中均未顯示出任何電泳條帶，這是因?yàn)樵谶@些PVY抗病品種中eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失，在此情況下，本研究所構(gòu)建的Bi-PASA分子標(biāo)記作為顯性分子標(biāo)記將這些抗病品種與半坤村曬煙及其他感病品種區(qū)分開來。

2.6 ?分子標(biāo)記在煙草PVY抗性回交改良中的應(yīng)用

為了使煙草PVY抗性回交改良子代鑒定工作簡(jiǎn)單高效可重復(fù)，并盡可能區(qū)分純合、雜合基因型，采用Bi-PASA遺傳標(biāo)記引物組合對(duì)K326×半坤村曬煙雜交后代回交群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行水平電泳，照相記錄結(jié)果。然后按照如下標(biāo)準(zhǔn)判斷煙草回交后代單株是否攜帶突變型PVY隱性抗病基因：電泳結(jié)果出現(xiàn)441 bp特異條帶，初步判斷該單株攜帶突變型PVY隱性抗病基因。如圖7所示，回交后代單株有2種基因型：1、4、5、7、8、11、14、16、17、19、21、22單株為雜合突變型（GC），電泳結(jié)果出現(xiàn)337 bp和441 bp特異條帶;其余單株為純合野生型（GG），電泳結(jié)果只出現(xiàn)337 bp特異條帶而沒有出現(xiàn)441 bp特異條帶。篩選出的雜合突變型單株可與受體親本繼續(xù)回交或供下一步育種利用，表明所構(gòu)建的Bi-PASA分子標(biāo)記可用于煙草PVY抗性回交改良。

3 ?討 ?論

采用Bi-PASA技術(shù)進(jìn)行SNP分型，僅需一次PCR擴(kuò)增和一次瓊脂糖電泳即可達(dá)到目的，是一種快速經(jīng)濟(jì)的SNP檢測(cè)方法。本研究基于品種資源半坤村曬煙中隱性抗病基因eIF4E1序列上的SNP位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)并開發(fā)了1個(gè)Bi-PASA標(biāo)記，用于eIF4E1抗病等位基因的分子標(biāo)記輔助選擇，以期為煙草抗PVY分子標(biāo)記輔助育種提供更加有力的技術(shù)支持。

目前煙草PVY抗病育種利用的抗源多數(shù)衍生自VAM，利用VAM及其衍生種育成的抗病品種往往圍繞eIF4E1基因發(fā)生大片段缺失，帶來的基因組變異尺度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SNP或小片段缺失[20]。上述原因不僅造成上百個(gè)功能基因的缺失，而且由于無(wú)法獲得缺失連接片段信息造成eIF4E1突變位點(diǎn)共顯性分子標(biāo)記無(wú)法開發(fā)，不利于隱性突變基因的連續(xù)回交定向轉(zhuǎn)育。半坤村曬煙的PVY抗性是由eIF4E1基因發(fā)生SNP突變產(chǎn)生的，本研究針對(duì)該SNP位點(diǎn)建立了Bi-PASA分子標(biāo)記作為共顯性分子標(biāo)記，能夠快速區(qū)分純合子和雜合子SNP分型，因此利用該標(biāo)記在煙草PVY抗性分子標(biāo)記輔助選擇育種中能夠縮短選擇時(shí)間，對(duì)隱性突變基因可以進(jìn)行不間斷的回交轉(zhuǎn)移，從而提高基因回交轉(zhuǎn)移速度，加快育種進(jìn)程。與其他分子檢測(cè)方法相比，Bi-PASA還具有許多優(yōu)點(diǎn)。Bi-PASA作為以普通PCR為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)單方法，實(shí)施過程中僅需一臺(tái)PCR擴(kuò)增儀、一套電泳設(shè)備和一些其他常用的PCR操作工具。與PCR-RFLP和傳統(tǒng)的AS-PCR不同，Bi-PASA只需一次PCR擴(kuò)增和一次瓊脂糖電泳即可達(dá)到分型的目的[12-13]。此外，盡管目前出現(xiàn)的基于大型儀器的高通量檢測(cè)方法比Bi-PASA效率高，如基因芯片技術(shù)、DHPLC、TaqMan MGB和高分辨溶解曲線分析法，但由于這些方法成本較高，無(wú)法常規(guī)使用[9-10]。

Bi-PASA引物設(shè)計(jì)是決定該技術(shù)檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。YE等[13]研究認(rèn)為，在內(nèi)引物的3′末端第2位引入錯(cuò)配堿基，并且通過選擇錯(cuò)配堿基類型，可以提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。衛(wèi)波等[21]分別在第2位和第3位引入錯(cuò)配堿基，發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同的SNP突變類型，加入錯(cuò)配堿基的位置和類型不同擴(kuò)增效果不同。本研究在Bi-PASA引物設(shè)計(jì)時(shí)，在各個(gè)內(nèi)引物3′末端的第2位或第3位分別引入不同類型錯(cuò)配堿基，然后通過PCR引物組合篩選獲得1組引物擴(kuò)增效果較好。結(jié)合已有研究報(bào)道和前期積累發(fā)現(xiàn)，在Bi-PASA內(nèi)引物3′末端引入錯(cuò)配堿是增加SNP基因分型準(zhǔn)確性的必要措施。

內(nèi)外引物的濃度比是反應(yīng)體系優(yōu)化的重要內(nèi)容，不同研究中優(yōu)化結(jié)果差別比較大。王齊旭等[17]在苦瓜抗白粉病分子標(biāo)記開發(fā)中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為10∶1;鄭煒佳等[22]在棉花SNP分型的研究中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為4∶1;KOU等[23]在甘薯的研究中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為2∶1;郝志明等[24]在小麥研究中，內(nèi)外引物濃度比為3∶2;田孟祥等[25]、姚姝等[26]和陳國(guó)鑫等[27]在水稻的研究中均將內(nèi)外引物的濃度比確定為1∶1，這與本試驗(yàn)的設(shè)置的內(nèi)外引物濃度比一致。對(duì)于本試驗(yàn)煙草SNP的檢測(cè)，在Bi-PASA反應(yīng)體系中4條引物濃度比設(shè)置為1∶1∶1∶1便獲得了滿意的特異性條帶，這可能還與引物的位置、Tm值和擴(kuò)增片段大小等有關(guān)。

退火溫度也是影響PCR特異性的重要因素，溫度過高擴(kuò)增不出特異性條帶，過低則雜帶多。本研究前期從大量引物組合中篩選出1組引物組合進(jìn)行更加深入的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，通過不斷提高退火溫度，可以有效降低非特異性條帶的擴(kuò)增，當(dāng)退火溫度達(dá)到58 ℃時(shí)，等位基因特征條帶清晰、明亮，擴(kuò)增產(chǎn)物含量最高，盡管外側(cè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶減弱或消失（圖2、4、5、6、7），但并不影響SNP分型檢測(cè)結(jié)果。

4 ?結(jié) ?論

本研究針對(duì)煙草PVY隱性抗病基因eIF4E1已知的G149C SNP位點(diǎn)建立了一種雙向等位基因特異性PCR分型方法，同時(shí)與傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR方法進(jìn)行了比較分析。研究結(jié)果表明，引物的合理設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件的優(yōu)化是成功建立雙向等位基因特異性PCR檢測(cè)方法的關(guān)鍵。相較于傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR方法，本研究建立的雙向等位基因特異性PCR方法能夠在1個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)出eIF4E1基因SNP位點(diǎn)的3種基因型（GG、GC、CC），操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，可以更好地促進(jìn)煙草抗PVY種質(zhì)資源的利用和新品種選育。

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