鹽酸提取大眼金槍魚骨中可溶性鈣工藝優(yōu)化

周瑜，唱惠宇，陳舜勝，2

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，上海 201306）

大眼金槍魚（Thunnus obesus）別稱肥壯金槍魚，鱸形目、鯖科、金槍魚屬，是一種分布廣泛的大洋性高洄游性魚類，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值［1-4］。目前，大眼金槍魚常用于制備生魚片和罐頭，產(chǎn)生了大量邊角料。在冷凍大眼金槍魚初加工過程中，大塊中軸骨被形態(tài)完整地分割下來，數(shù)量及其可觀［5］。由于金槍魚骨腥味重、骨質(zhì)硬，無法做出香酥魚骨排、骨粒脆等常見的魚骨休閑食品，因此多被積壓在冷庫中或粗加工成魚粉，經(jīng)濟(jì)效益極低，其高值化利用工藝有待開發(fā)。魚骨的主要成分是灰分、蛋白質(zhì)和粗脂肪?；曳种懈缓粤u基磷灰石結(jié)晶的形式存在的生物鈣，且鈣磷比有利于人體吸收［6］。魚骨鈣的提取工藝優(yōu)化對(duì)高值化利用大眼金槍魚骨具有重要意義。

膠原蛋白占魚骨有機(jī)成分的30%，膠原蛋白與鈣鹽結(jié)合讓魚骨結(jié)構(gòu)更致密，導(dǎo)致鈣的溶解度極低，因此采用煮制等簡(jiǎn)單的物理提取方法無法有效地析出［7］。研究者圍繞魚骨鈣的提取工藝和應(yīng)用開展了大量工作.目前，有效提取骨鈣的方法主要有酸法、醇?jí)A法和酶解法，其中醇?jí)A法對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的破壞較大［8］，張宏梅等［9］用木瓜蛋白酶提取羅非魚中的可溶性鈣，在酶底比為3%，pH值為4.0，酶解時(shí)間為10 h的條件下，提取率為2.89%，酶法的提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、工藝繁瑣且成本高。采用酸法提取魚骨鈣較為主流。楊淑曉等［10］用鹽酸提取虹鱒魚骨中的可溶性鈣，在鹽酸濃度為3.4 mol/L、提取溫度為52 ℃、提取時(shí)間為2.1 h 的條件下得可溶性鈣提取率為28.45%，何云［11］用鹽酸提取鮟鱇魚骨中的鈣，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定優(yōu)選范圍后通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)參數(shù)組合，提取率為31.21%。毛毛等［12］設(shè)計(jì)了真鱈魚骨膠原肽及魚骨鈣聯(lián)產(chǎn)工藝，以去除膠原蛋白的魚骨粉為原料通過2 次提取法獲取果酸鈣，得率為93.8%，雙次提取工藝較為繁瑣。在常壓和高壓2種情況下用食醋溶出脫脂黃花魚骨中的鈣，結(jié)果表明，常壓和高壓下醋酸濃度都為0.9 mol/L，料液比為1∶20，常壓下浸泡時(shí)間為60 min，高壓為45 min，常壓下浸泡溫度60 ℃，但溶出率均低于45%［13］。白艷等［14］通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到鹽酸提取鰻魚骨鈣的最佳組合為3 mol/L鹽酸、用量 4 mL、反應(yīng)溫度 108 ℃、反應(yīng)時(shí)間 60 min，該條件下鰻魚骨鈣溶出率為 22.29%，達(dá)到最大。張龍等［15］也用鹽酸對(duì)鰻魚骨鈣進(jìn)行提取，最優(yōu)條件為3 mol/L 鹽酸、用量4 mL、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間150 min，得率為81.31%，較白艷等的提取率高。通過前人的研究得出，酸法的提取率高、耗時(shí)短、成本低、副作用小，是一種較好的提鈣方法。

為了最大限度地利用金槍魚骨鈣資源，為后續(xù)生產(chǎn)鈣制劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)參考。本研究擬測(cè)定大眼金槍魚骨的基本成分，并以其為原料，以鈣提取率為指標(biāo)，采用單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸提取可溶性鈣的工藝條件，提高金槍魚骨鈣提取率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大眼金槍魚魚骨，購自上海沃域食品有限公司，置于-20 ℃冰箱貯藏。鹽酸，硝酸均為分析純，上?？蚂`斯試劑有限公司；乙酸，乳酸均為分析純，上海泰坦科技股份有限公司Greagent品牌；無水檸檬酸，分析純，Adamas試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

XM-2500旭曼搖擺式高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，DHG-9053A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Kjeltec 8400 FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀，Soxtec 2050 索氏脂肪提取儀，F(xiàn)OSS（福斯）公司；Thermo iCAP Q 等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀HPLCICPMS，美國(guó)熱電公司；ZEEnit 700 原子吸收光譜儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；日立SU5000熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日立有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大眼金槍魚骨粉的制備 剔除魚骨上殘留的魚肉，流水沖洗，除去血污等雜質(zhì)，用剪刀沿骨節(jié)處剪斷，得到長(zhǎng)度約為3 cm的骨段，洗凈。將骨段置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，55 ℃干燥10 h。干燥后的魚骨用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，得到大眼金槍魚骨粉。

1.3.2 基本成分的測(cè)定 水分含量測(cè)定：直接干燥法，參照《GB 5009.3-2016 食品中水分的測(cè)定 直接干燥法》；灰分含量的測(cè)定：灼燒法，參照《GB 5009.4-2016 食品中灰分的測(cè)定 食品中總灰分的測(cè)定》；粗蛋白含量的測(cè)定：自動(dòng)凱氏定氮法，參考《GB5009.5-2016 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定 凱氏定氮法》，略有改動(dòng)，將魚骨粉0.2 g，五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.4 g，硫酸鉀（K2SO4）3.5 g，濃硫酸12 ml放入洗凈干燥的消化管中，石墨消解儀升溫至421 ℃，消化47 min，至消化液呈清透狀態(tài)，上機(jī)測(cè)定；粗脂肪含量的測(cè)定：索氏抽提法，參照《GB5009.6-2016食品中脂肪的測(cè)定 索氏抽提法》。

1.3.3 礦物質(zhì)及微量元素測(cè)定 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS），參照《GB 5009.268-2016食品中多元素的測(cè)定 電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）》，采用微波消解前處理。ICP-MS條件：KED 模式；射頻功率1 500 W；等離子體氣流量15 L/min；載氣流量0.80 L/min；輔助氣流量0.40 L/min。氦氣流速4.2 mL/min；霧化器4 ℃；蠕動(dòng)泵40 r/min。

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)的觀察 將魚骨粉冷凍干燥后固定在導(dǎo)電膠上，真空噴金，加速電壓6 kV，使用掃描電鏡觀察不同放大倍數(shù)下的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 可溶性鈣提取的單因素試驗(yàn) 參考何云［11］的方法，準(zhǔn)確稱取1.000 g魚骨粉，料液比10∶1，70 ℃水浴加熱60 min的基礎(chǔ)條件下，保持其他條件不變，只改變其中一個(gè)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以可溶性鈣提取率為指標(biāo)，設(shè)置鹽酸濃度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mol/L）、提 取 時(shí) 間（30、40、50、60、70、80、90 min）、液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）以及提取溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化可溶性鈣提取工藝的試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取率為響應(yīng)變量，以酸濃度、液料比和提取時(shí)間3 個(gè)因素為自變量（考察因子），采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究各因素交互作用下提取率的變化規(guī)律，試驗(yàn)因素及水平編碼見表1。

表1 可溶性鈣提取工藝優(yōu)化的試驗(yàn)因素編碼及水平Table 1 Code and level of factors chosen for soluble calcium extraction process optimization

1.3.7 提取液中可溶性鈣含量的測(cè)定 火焰原子吸收光譜法，參考《GB 5009.92-2016 食品中鈣的測(cè)定 火焰原子吸收光譜法》，略有改動(dòng)?；鹧嬖游展庾V條件：燈電流1.0 mA；波長(zhǎng)422.7 nm；狹縫0.2 nm；負(fù)高壓-350 V；空氣流量5.0 L/min；乙炔氣流量1.0 L/min。

1.3.7.1 鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 鈣標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中鈣的質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40、60 mg/L，利用火焰原子吸收光譜儀測(cè)定吸光度值。以鈣濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1.3.7.2 可溶性鈣含量的測(cè)定 待反應(yīng)結(jié)束后過濾，取濾液稀釋、混勻，過0.22 μm 濾膜，導(dǎo)入火焰原子化器，記錄吸光值。將吸光值代入（1）式，乘對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得到提取液中的可溶性鈣含量。

1.3.8 提取率計(jì)算

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 和 IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行處理和方差分析，采用Design Expert 8.0.6 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，采用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大眼金槍魚骨的基本成分

大眼金槍魚骨的基本成分見表2，其中，灰分含量為49.30 g/100g，高于列表中大多數(shù)魚類魚骨的灰分含量［16］，灰分中富含鈣，因此大眼金槍魚骨適宜作為提取鈣元素的天然原料。蛋白質(zhì)和水分含量分別為27.44和6.46 g/100g，和其他魚類的差別不大；脂肪含量相對(duì)較低，為9.81 g/100g。

表2 大眼金槍魚骨的基本成分及與其他魚類的比較Table 2 The basic composition of bigeye tuna bone and its comparison with other fish （g·100g-1）

2.2 大眼金槍魚骨的礦物質(zhì)和微量元素含量

由表3 可知，大眼金槍魚骨中Ca 含量高達(dá)164.7 mg/g，高于鯖魚（143 mg/g）、鮭魚（135 mg/g）和虹鱒魚（147 mg/g）［16］。研究表明，成人膳食中鈣磷比為1∶1～2∶1時(shí)最利于腸道對(duì)Ca的吸收［17］，大眼金槍魚骨中P含量為81.6 mg/g，鈣磷比約為2∶1，接近人體的鈣磷比，符合膳食營(yíng)養(yǎng)要求。此外，其還含有Fe（904.79 mg/kg）、Zn（68.23 mg/kg）、Al（25.71 mg/kg）、Se（0.25 mg/kg）等微量元素，對(duì)維持人體正常的生理功能有一定作用。

表3 大眼金槍魚骨的礦物質(zhì)和微量元素含量Table 3 The mineral and trace element content of bigeye tuna bone （mg·kg-1）

2.3 大眼金槍魚骨的掃描電鏡觀察

骨組織中的主要無機(jī)成分為羥基磷灰石結(jié)晶和無定型磷酸鈣［18］。魚骨中不同類型鈣鹽具有不同的形態(tài)，以羥基磷灰石為代表的晶體鈣鹽呈片狀，非晶體鈣鹽多以無定形的CaHPO4形式存在［7］。根據(jù)圖1可知，大眼金槍魚骨表面不含孔隙、結(jié)構(gòu)致密，同時(shí)含有片狀形態(tài)的羥基磷灰石晶體鈣鹽和無定型的磷酸鈣非晶體鈣鹽，因此通過簡(jiǎn)單的溶解方式無法有效地使鈣溶出，可通過酸破壞魚骨內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，提取可溶性鈣。

圖1 不同放大倍數(shù)下大眼金槍魚骨的SEM圖Figure 1 The SEM photograph of bigeye tuna bone under different magnifications

2.4 可溶性鈣提取的單因素試驗(yàn)

2.4.1 酸濃度對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 g魚骨粉，用不同濃度的鹽酸提取可溶性鈣.酸用量10 mL，70 ℃水浴加熱60 min。測(cè)定上清液中可溶性鈣濃度，計(jì)算提取率。由圖2可知，隨著酸濃度的增大，鈣的提取率先增大后趨于穩(wěn)定。酸濃度影響酸性的強(qiáng)弱，酸性越強(qiáng)，對(duì)骨膠原蛋白的破壞越強(qiáng)，魚骨鈣更易溶出，可溶性鈣提取率增加。酸濃度從0.3 mol/L 增大到0.9 mol/L 的過程中，提取率顯著提高（P<0.05）。酸濃度為0.9 mol/L 時(shí)，鈣提取率最高，達(dá)到77.93%。后續(xù)再增加酸濃度，提取率略有降低，且無顯著性差異（P<0.05），可能原因是0.9 mol/L 的鹽酸對(duì)骨膠原蛋白的作用達(dá)到最佳效果。因此，選取0.9 mol/L 為優(yōu)化后的酸濃度，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 鹽酸濃度對(duì)鈣提取率的影響Figure 2 The effect of hydrochloric acid concentration on the extraction rate of calcium

2.4.2 液料比對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 g魚骨粉，改變液料比（鹽酸溶液用量mL∶魚骨粉質(zhì)量g）提取可溶性鈣。酸濃度均為0.9 mol/L，70 ℃水浴加熱60 min。測(cè)定上清液中可溶性鈣濃度，計(jì)算提取率，由圖3可知，液料比直接關(guān)系到魚骨粉和鹽酸溶液的接觸面積，是影響鈣提取效果的重要因素.由圖4可知，隨著液料比的增加，魚骨鈣的提取率逐漸上升，這是由于鹽酸和魚骨粉間的濃度差和接觸面積越大，鈣就越能夠充分溶出、提取效率就越高［19］。液料比6∶1 至14∶1 范圍內(nèi)，提取率顯著增加（P<0.05）.液料比14∶1 和16∶1 時(shí)，提取率分別為78.32% 和80.67%，增長(zhǎng)率無顯著性差異（P<0.05）。從節(jié)約資源和降低成本角度考慮，選取14∶1為優(yōu)化后的液料比，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 驗(yàn)液料比對(duì)鈣提取率的影響Figure 3 The effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of calcium

2.4.3 提取溫度對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 g 魚骨粉，改變提取溫度。酸濃度均為0.9 mol/L，液料比14∶1，水浴加熱60 min。測(cè)定上清液中可溶性鈣濃度，計(jì)算提取率，由圖4可知，隨著提取溫度的升高，分子的能量增加、運(yùn)動(dòng)速度加快，反應(yīng)物之間的有效碰撞加劇，最終導(dǎo)致反應(yīng)速率的增大.提取溫度從30 ℃上升至80 ℃的過程中，鈣提取率總體呈上升趨勢(shì)，40 至50 ℃和60 至70 ℃略有降低，但無顯著性差異（P<0.05），可能原因是鹽酸的揮發(fā)作用。提取溫度80 ℃時(shí)，鈣提取率為83.50%，溫度上升10 ℃后，提取率為83.53%，無顯著性差異（P<0.05），推測(cè)提取溫度高于80 ℃后，鹽酸的揮發(fā)和鈣的溶出達(dá)到平衡狀態(tài)，故選取80 ℃為優(yōu)化后的提取溫度，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對(duì)鈣提取率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on calcium extraction rate

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 g 魚骨粉，改變提取時(shí)間。酸濃度均為0.9 mol/L，液料比14∶1，水浴溫度80 ℃。測(cè)定上清液中可溶性鈣濃度，計(jì)算提取率，由圖5可知，提取時(shí)間從30 min 延長(zhǎng)至40 min，提取率顯著增高（P<0.05）。隨著酸解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（40～70 min），鈣的溶出率的增加不顯著（P<0.05）。提取時(shí)間為80 min 時(shí)，鈣提取率最高，達(dá)到85.09%，延長(zhǎng)至90 min后反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。綜合考慮提取效率和鹽酸揮發(fā)，得到優(yōu)化后的提取時(shí)間為80 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)鈣提取率的影響Figure 5 Effect of extraction time on calcium extraction rate

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化可溶性鈣提取工藝的結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知，水浴溫度過高導(dǎo)致酸的揮發(fā)速度加快、酸濃度下降，溫度上升至80 ℃，提取率達(dá)到較高水平，再升溫提取率反而呈下降趨勢(shì)［20］。因此，本研究對(duì)4個(gè)單因素進(jìn)行篩選后，固定提取溫度為80 ℃，選取鹽酸濃度（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見表4。

利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立可溶性鈣提取率對(duì)考察因子酸濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

提取率（%）=84.37+2.99A+0.46B+1.23C+1.30AB+0.22AC-0.17BC-6.55A2-5.80B2-4.32C2

對(duì)該擬合模型進(jìn)行方差分析和顯著性分析，由表5 可知，該模型F=66.37，達(dá)到了極顯著水平（P<0.000 1），失擬項(xiàng)F=0.21，P=0.887 9>0.05，無顯著影響，因此該模型可以用于實(shí)際情況的模擬。由表6可知，二次項(xiàng)方程的決定系數(shù)R2=0.988 4，說明該模型中鈣提取率的實(shí)際值和測(cè)量值有較高的吻合度，校正決定系數(shù)R2adj=0.973 5，說明鈣提取工藝有97.35%的程度受到鹽酸濃度、液料比和提取時(shí)間的影響，預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2pred=0.959 6，說明模型有良好的預(yù)測(cè)性，因此該模型和回歸方程準(zhǔn)確率較高，可用于對(duì)分析結(jié)果的擬合與預(yù)測(cè)［21］。變異系數(shù)CV反映試驗(yàn)結(jié)果和真實(shí)值的偏差，該模型的變異系數(shù)為1.240 7%，說明可靠性較高。因素的F值越大，該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之越小［22］。表5中，一次項(xiàng)A和C對(duì)鈣提取率的影響極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)鈣提取率的影響顯著（P<0.05），二次項(xiàng)A2，B2和C2極顯著（P<0.01）。酸濃度（A）的F 值最大，提取時(shí)間（C）次之，液料比（B）的F值最小，說明三者對(duì)鈣提取率的影響順序?yàn)椋核釢舛龋ˋ）＞提取時(shí)間（C）＞液料比（B）。

表6 響應(yīng)面方差分析相關(guān)系數(shù)Table 6 Response surface analysis of variance correlation coefficient

2.5.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)模擬出的3D 曲面圖和2D 等高線圖能夠更加直觀地反映各因素之間對(duì)鈣提取率的交互作用情況。3D曲面的坡度越陡峭，響應(yīng)面值受到考察因子的影響越敏感［23］。2D 等高線呈馬鞍形或橢圓形，等高線密集，說明因素之間交互作用顯著，等高線呈圓形，說明因素之間交互作用不顯著［24］。酸濃度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)鈣提取率影響的3D曲面圖和2D等高線圖見圖6。3個(gè)曲面圖均為凸型曲面，都具有一定坡度，鈣提取率隨因素的變化先升后降，其中，圖6-A 的3D曲面圖坡度最陡峭，等高線圖呈橢圓形，說明酸濃度和液料比交互作用對(duì)鈣提取率的影響最為顯著，與表5結(jié)果一致。圖6-B酸濃度與提取時(shí)間，圖6-C液料比與提取時(shí)間的曲面坡度較平緩，等高線接近于圓形，兩兩交互作用對(duì)該提取率的影響不顯著，與表5結(jié)果對(duì)應(yīng)。

圖6 各因素的交互作用對(duì)鈣提取率的影響Figure 6 The effect of the interaction of various factors on the extraction rate of calcium

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

2.5.3 響應(yīng)面模型優(yōu)化及驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.0.6 軟件Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化得到金槍魚骨提取鈣的最佳工藝條件為：酸濃度0.97 mol/L、液料比14.13∶1、提取時(shí)間81.47 min，鈣提取率預(yù)測(cè)值為84.83%，考慮到實(shí)際操作過程，修正后的工藝優(yōu)化條件為：酸濃度1.00 mol/L、液料比14∶1、提取時(shí)間80 min。采用修正后的工藝條件進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，得到鈣提取率為84.21%，說明該回歸模型可用于實(shí)際情況的模擬。

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了大眼金槍魚骨的基本成分和礦物質(zhì)含量，其中鈣含量高達(dá)164.7 mg/g，金槍魚骨可以做為一種良好的天然鈣源加以利用。通過掃描電鏡觀察，魚骨的表面無孔隙，結(jié)構(gòu)致密，利用酸溶解得到鈣是一種高效的方法?；趩我蛩卦囼?yàn)，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定用鹽酸溶液提取大眼金槍魚骨鈣的優(yōu)化工藝參數(shù)：鹽酸濃度為1.00 mol/L、液料比14∶1、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間80 min，鈣提取率高達(dá)84.21%。本研究可為大眼金槍魚骨用于制備鈣制劑及高值化利用魚骨資源提供技術(shù)指導(dǎo)并奠定研究基礎(chǔ)。