HPLC 法同時測定芍藥甘草湯中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

崔 悅， 高 興， 趙 雪， 馮 波， 關(guān) 皎， 朱鶴云

（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013）

芍藥甘草湯出自漢代張仲景所著的 《傷寒論》， 由芍藥和甘草兩味中草藥按1：1 配伍組成。 盡管方劑組成簡單，但配伍明確，其中，芍藥為君藥， 甘草為使藥， 本方具有良好的止痛藥效，可調(diào)和肝脾、緩急止痛。 芍藥活血、養(yǎng)陰；甘草益氣補中，二者相輔相成，臨床應(yīng)用廣泛（錢浩良等，2020）。 有文獻報道，芍藥甘草湯可以治療胃腸道疾病、皮膚瘙癢、痙攣、減輕頸椎間盤炎癥、支氣管哮喘等病癥（何堅等，2020；何飛等，2020；高志剛等，2019；趙征昊，2018；朱廣偉等，2014）。 此外還可聯(lián)合拉米夫定治療慢性乙肝（李玢玢等，2020）。 陳劍等（2021）對不同配伍比例的芍藥甘草湯治療腦卒中下肢運動功能障礙的效果進行了研究，結(jié)果表明，芍藥比例越高，治療效果越好。 芍藥甘草湯的主要活性成分為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷（茍麗瓊等，2018），研究表明，芍藥苷能夠保護心血管、 降低血壓 （Louise 等，2018）， 芍藥內(nèi)酯苷能夠保護肝臟 （任敏霞等，2020）、抗抑郁（郭超峰等，2019）。傳統(tǒng)中草藥芍藥甘草湯在獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域已有應(yīng)用。 范占煉等（2020）給予癱瘓奶牛芍藥甘草湯治療，奶牛病癥得以恢復(fù)，起到了很好的效果。本研究以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為研究對象， 采用高效液相色譜法測定其含量， 以期為芍藥甘草湯在獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域的質(zhì)量控制和應(yīng)用提供一定參考， 為相關(guān)藥用制劑及飼料的研究開發(fā)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司LC-20A 型高效液相色譜儀， 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司FA224型電子天平，上海愛郎儀器有限公司CCA-1112A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 昆山市超聲儀器有限公司KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，天津市泰斯特儀器有限公司98-1-C 型數(shù)字控溫電熱套。

1.2 材料 乙腈和甲醇為色譜純 （美國Fisher Scientific 公司），磷酸為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），所用水為屈臣氏純凈水，其他試劑均為分析純。 對照品芍藥苷（批號20030901）和芍藥內(nèi)酯苷（批號19121705）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。芍藥、炙甘草均購自吉林市吉林大藥房，產(chǎn)地分別為安徽、內(nèi)蒙古。 芍藥為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall 的干燥根，炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 的干燥根和根莖，樣本留存于吉林醫(yī)藥學(xué)院中藥樣品室。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合對照品溶液的配制 取芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷對照品適量置于5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的混合對照品儲備液，濃度均為1.0 mg/mL，4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備 按照《傷寒論》中芍藥甘草湯處方的配比，稱取藥材白芍12 g，炙甘草12 g 于1000 mL 圓底燒瓶中，加入屈臣氏純凈水240 mL，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，提取液用5 層紗布過濾， 殘渣再加240 mL 屈臣氏純凈水繼續(xù)回流1 h，合并兩次所得濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到50 mL， 置于容量瓶中，4 ℃冷藏，備用。 取上述提取物0.5 mL，置于不同的50 mL 具塞錐形瓶中，取甲醇25 mL 超聲30 min，過濾，取續(xù)濾液用0.22 μm 微孔濾膜過濾后即得。

1.3.3 色譜條件 采用日本島津公司Shim-Pack XR-ODS 柱（75 mm×3.0 mm，2.2 μm），預(yù)柱為日本島津公司C18 保護柱（4 mm×3.0 mm，2.2 μm），流動相為0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）（86:14），等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為232 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對照品， 芍藥甘草湯樣品的典型色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、芍藥甘草湯樣品（B）的HPLC 色譜圖

1.3.4 線性關(guān)系 分別精密吸取“1.3.1”項下的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋配制成芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷系列稀釋混合對照品溶液，兩種成分的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL；1.25、2.5、5、12.5、25、50 μg/mL；取上述溶液200 μL，進樣分析。 橫坐標為對照品質(zhì)量濃度X（μg/mL），縱坐標為色譜峰面積（Y），線性回歸計算。

1.3.5 精密度實驗 取上述制備的混合對照品溶液（芍藥苷質(zhì)量濃度為50 μg/mL，芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL）200 μL，進樣分析。 連續(xù)進樣6 次，計算峰面積RSD。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗 取同一批次的芍藥甘草湯200 μL，進樣分析。室溫下放置0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積RSD。

1.3.7 重復(fù)性實驗 取同一批芍藥甘草湯6 份，按“1.3.2”項下方法制備供試品溶液。 取供試品溶液200 μL 進樣分析，記算峰面積RSD、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。

1.3.8 回收率實驗 取已知含量的芍藥甘草湯樣品各9 份，每份0.25 mL，分別向各樣品中加入相當于樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量80%、100%、120%的對照品溶液各3 份，按“1.3.2”項下方法制得供試品溶液，進樣分析，計算芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的回收率和RSD。

1.3.9 樣品含量測定 按“1.3.2”項下的方法制備供試品溶液， 進樣分析并計算芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法驗證

2.1.1 線性關(guān)系 芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷的線性回歸 方 程 分 別 為：Y＝3.347×104X-1.020×105（r＝0.9996）；Y＝2.083×104X-7.717×103（r＝0.9998）。 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別在5 ～200 μg/mL；1.25 ～50 μg/mL 內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度實驗 芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷峰面積的RSD 分別為1.5%、0.38%，說明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 芍藥甘草湯中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷峰面積的RSD 分別為2.6%、1.6%，芍藥水提物中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷峰面積的RSD 分別為2.3%、2.8%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性實驗 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在芍藥甘草湯中的平均含量分別為3.44、0.829 mg/mL，RSD 分別為2.1%和2.5%； 在芍藥水提物中的平均含量分別為3.57 mg/mL 和0.886 mg/mL，RSD分別為2.4%和1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 回收率實驗 兩種成分的回收率和RSD結(jié)果見表1。

表1 芍藥甘草湯樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的回收率

2.2 含量測定 6 批芍藥甘草湯樣品測定結(jié)果見表2。 芍藥甘草湯中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量分別為3.16 ～3.46 mg/mL、0.739 ～0.886 mg/mL。

表2 芍藥甘草湯樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量mg/mL

3 討論與結(jié)論

實驗初期以水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈作為流動相考察體系。 采用0.1%磷酸水-乙腈（86：14）作為流動相時分離效果最佳，13 min 即可完成分析且無干擾峰存在。

在全波長掃描的基礎(chǔ)上， 對芍藥甘草湯中的兩種活性成分（芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷）進行光譜掃描， 兩種成分在232 nm 波長下檢測到的色譜峰最強， 基線較為穩(wěn)定， 獲得信息較為全面， 故以232 nm 作為檢測波長。

在考察了芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷出峰時間和分離效果的基礎(chǔ)上， 分別試用了等度和梯度兩種洗脫程序。 實驗選擇的流動相為0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）。 當梯度洗脫時程序設(shè)定為：0 ～5 min，10%B→20%B；5 ～10 min，20%B→25%B；10 ～15 min，25%B→35%B；15 ～18 min，35%B→43%B 時，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷分離效果不佳且雜質(zhì)峰干擾嚴重；而采用等度洗脫：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）（86:14）時，芍藥甘草湯樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的分離效果和出峰時間均較好且雜質(zhì)峰無干擾，故最終確定使用等度洗脫程序。

本實驗對比了超聲法和回流法對芍藥甘草湯中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷兩種活性成分的提取效果，結(jié)果表明，超聲法提取率較高。 此外，亦對提取溶劑進行了考察。 分別試驗了50%、70%、100%乙醇溶液，50%、70%、100%甲醇溶液。最終以綜合提取率最高的100%甲醇作為提取溶劑。

本文建立了一種同時測定芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的HPLC 分析方法， 并應(yīng)用到了芍藥甘草湯兩種活性成分的含量測定中。該方法具有專屬性強、穩(wěn)定性良好且分析時間短的特點。 本研究可為芍藥甘草湯在獸藥及飼料領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)，有助于芍藥甘草湯在飼料行業(yè)的開發(fā)，并提供一定的質(zhì)量標準參考。