高效液相色譜法檢測(cè)飼料中6 種游離氨基酸

劉成模， 楊 曦 ， 莫彩娜， 陳小燕， 任秋香， 黃智成

（1.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東湛江 524094；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524094）

飼料蛋白質(zhì)的氨基酸不平衡會(huì)降低蛋白質(zhì)效率， 用合成的氨基酸來(lái)平衡飼料中氨基酸比例是提高飼料蛋白質(zhì)利用率和節(jié)約蛋白質(zhì)資源， 降低飼料成本的途徑之一 （占秀安等，2007）。 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，?；撬嶂饕挥米魑r類(lèi)誘食劑（Fuzessery 等，1978）。 有研究表明，比目魚(yú)飼料中添加1.4%的牛磺酸能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高蛋白質(zhì)效率比（Park 等，2002）；草魚(yú)飼料中適量添加?；撬幔?00 ～1400 mg/kg），能提高特定生長(zhǎng)率、飼料效率和蛋白質(zhì)效率，降低草魚(yú)體水分，增加體蛋白和體脂（蘿莉等，2006）。因此，準(zhǔn)確、快捷、低成本地測(cè)定飼料中?；撬幔═aurine）、蘇氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、賴(lài)氨酸（Lys）6 種游離氨基酸含量，對(duì)于飼料配方設(shè)計(jì)，提高養(yǎng)殖效率具有十分重要的意義。

GB/T 18246-2019《飼料中氨基酸的測(cè)定》對(duì)飼料中游離氨基酸的測(cè)定采用氨基酸分析儀檢測(cè)，氨基酸分析儀成本比較高，檢測(cè)時(shí)間也比較長(zhǎng)，不利于一般企業(yè)開(kāi)展，同時(shí)也不利于大批量樣品檢測(cè)。 本實(shí)驗(yàn)采用0.1 mol/L 鹽酸溶液提取樣品中的6 種游離氨基酸， 與1% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）溶液衍生后經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定其含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器和工作站）， 美國(guó)安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；PHS-3E pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-BD 型電熱恒溫水浴箱， 上海新諾儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 主要試劑 6 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品： ?；撬幔═aurine）、蘇 氨 酸（Thr）、甘 氨 酸（Gly）、纈 氨 酸（Val）、 蛋氨酸 （Met）、 賴(lài)氨酸 （Lys）（純度均≥98%），美國(guó)Sigma 公司；2，4-二硝基氟苯（DNFB）（＞99.0%），麥克林公司；乙腈為色譜純，無(wú)水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉均為分析純；水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18 （4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序

1.3 樣品前處理 稱(chēng)取已制好的飼料樣品2 g（準(zhǔn)確至0.0001 g）于100 mL 燒杯中，加入50 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液，用玻璃棒攪拌約1 min，置于超聲波儀中常溫超聲30 min（中間用玻璃棒攪拌2 次），超聲完畢后用氫氧化鈉溶液調(diào)溶液至中性（先加0.4 mL 40%氫氧化鈉溶液， 再用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液慢慢調(diào)成中性）， 然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。 最后取約50 mL 溶液于離心管中，4000 r/min 離心10 min，上清液待用。

1.4 衍生化 分別移取500 μL 上述上清液和6種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)系列混合液于帶蓋試管中，依次準(zhǔn)確加入500 μL 碳酸鈉緩沖溶液 （pH=9.0）、500 μL 1%（DNFB）2，4-二硝基氟苯溶液，蓋上塞子，漩渦混勻，于60 ℃水浴中避光反應(yīng)60 min。取出，冷卻至室溫，再加磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）3.5 mL，漩渦混勻，靜置15 min。 衍生后的試液過(guò)0.45 μm 水系濾頭過(guò)濾，濾液上機(jī)待測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 提取方式和提取時(shí)間的選擇 稱(chēng)取同一份已制好飼料樣品，分別采用振蕩和超聲兩種方式提取，每種提取方式分別進(jìn)行5、15、30、40、50、60 min。 由表2 可知， 不同時(shí)間振蕩和超聲提取結(jié)果基本相同，說(shuō)明振蕩和超聲兩種方式對(duì)6 種游離氨基酸的提取無(wú)影響， 為確保6 種游離氨基酸能夠完全提取，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取，提取時(shí)間為30 min。

表2 振蕩和超聲不同時(shí)間提取效果%

2.2 提取后樣品溶液pH 的選擇 氨基酸和衍生劑2，4-二硝基氟苯反應(yīng)所需的環(huán)境為弱堿性，加入500 μL 碳酸鈉緩沖液（pH=9.0）確保反應(yīng)環(huán)境為弱堿性，提取液為0.1 mol/L 鹽酸溶液，酸性，故在衍生前對(duì)樣品進(jìn)行堿化。 由表3 可知， 樣品pH 為3 ～9 時(shí)，6 種游離氨基酸的結(jié)果基本相同，說(shuō)明樣品pH3～9 對(duì)種游離氨基酸的結(jié)果基本沒(méi)有影響，但衍生劑產(chǎn)物色譜峰隨pH 增大而升高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇將樣品提取液pH 調(diào)成7，接近標(biāo)準(zhǔn)溶液pH。

表3 提取后樣品溶液pH對(duì)游離氨基酸含量的影響%

2.3 衍生劑用量和衍生時(shí)間的選擇 對(duì)同一飼料樣品分別加1% 2，4-二硝基氟苯溶液50、100、200、300、400、500、600、700 μL，最后加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）至溶液體積為5 mL。由表4 和表5可知，衍生劑用量從50 ～500 μL 時(shí)，隨衍生劑用量加大，6 種游離氨基酸結(jié)果不斷增大， 衍生劑用量超過(guò)500 μL 后，6 種游離氨基酸的結(jié)果基本相同，說(shuō)明衍生劑用量低于500 μL，6 種游離氨基酸與衍生劑反應(yīng)不完全。 衍生時(shí)間從5 ～60 min 時(shí)， 隨衍生時(shí)間越長(zhǎng)，6 種游離氨基酸結(jié)果不斷增大，衍生劑時(shí)間超過(guò)60 min 后，6 種游離氨基酸的結(jié)果基本相同， 說(shuō)明衍生時(shí)間低于60 min，6 種游離氨基酸與衍生劑反應(yīng)不完全。說(shuō)明樣品中6 種游離氨基酸與衍生劑完全反應(yīng)需要至少500 μL 衍生劑反應(yīng)60 min 以上，但衍生劑產(chǎn)物色譜峰隨衍生時(shí)間延長(zhǎng)而升高。 因此，本實(shí)驗(yàn)選擇衍生劑為500 μL 1% 2，4-二硝基氟苯溶液和衍生時(shí)間60 min。

表4 衍生劑用量對(duì)游離氨基酸含量的影響%

表5 衍生時(shí)間對(duì)游離氨基酸含量的影響%

2.4 線(xiàn)性關(guān)系、 線(xiàn)性范圍、LOD 和LOQ 取6種 標(biāo) 準(zhǔn) 濃 度 為10、20、50、100、150、200 μg/mL混合氨基酸500 μL 按本實(shí)驗(yàn)操作，以氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到6 種氨基酸的工作曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍，在本實(shí)驗(yàn)條件下，按信燥比S/N=3 計(jì)算，求得飼料中的（LOD）檢出限，按信燥比S/N=10 計(jì)算，求得定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 線(xiàn)性關(guān)系、線(xiàn)性范圍、LOD 和LOQ

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取已處理好的供試溶液， 按本實(shí)驗(yàn)色譜條件，分別在0、4、8、12、16、24 h，測(cè)其峰面積，6 種游離氨基酸RSD 為0.526% ～0.865%，結(jié)果表明供試溶液24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定（表7）。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一飼料樣品6 份，按本實(shí)驗(yàn)測(cè)定，6 種游離氨基酸的含量以變異系數(shù)CV計(jì)為2.55% ～2.76%。

表8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量飼料6 份，分別添加一定濃度的6 種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見(jiàn)表9，6 種游離氨基酸最低回收率超過(guò)92%。

表9 添加不同水平游離氨基酸回收率%

2.8 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法與本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果對(duì)比 取不同飼料樣品， 分別采用本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)6 種游離氨基酸。 結(jié)果表明，兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（表10）。

表10 不同樣品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法與本方法結(jié)果比對(duì)%

3 討論

因?yàn)榇蠖鄶?shù)氨基酸不含芳香環(huán)等紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)， 無(wú)法直接用紫外和可見(jiàn)光吸收法檢測(cè)， 需先將氨基酸衍生轉(zhuǎn)化成具有較強(qiáng)紫外或者熒光吸收的衍生產(chǎn)物。 衍生方式有柱前衍生法和柱后衍生法。 柱后衍生法的主要缺點(diǎn)：（1）色譜儀器較復(fù)雜， 需額外的泵和反應(yīng)器以保證洗脫液與柱后試劑均勻組合，這樣使儀器局限于一類(lèi)分析。（2）在茚三酮方法中單波長(zhǎng)影響因素比較大，常需雙波長(zhǎng)檢測(cè)，使儀器更加復(fù)雜、昂貴。 故本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生檢測(cè)飼料中游離氨基酸含量。 一般用于柱前衍生劑有異硫氰酸苯酯、 丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸、 鄰苯二甲醛、9-芴基甲氧基羰酰氯和2，4-二硝基氟苯等。 綜合考慮柱前衍生劑優(yōu)缺點(diǎn)， 本實(shí)驗(yàn)采用2，4-二硝基氟苯作為柱前衍生試劑。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中6種游離氨基含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法分析速度快，回收率和重復(fù)性比較好。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，是一種可快速、準(zhǔn)確測(cè)定飼料中6 種游離氨基酸含量的方法。