雞ANP32家族蛋白亞細胞定位及其在免疫器官中的表達特征分析

邢靜如，石海英，王燕碧，趙采芹，唐 宏，段志強

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】酸性亮氨酸磷酸核蛋白（Acidic leucine nuclear phosphoprotein 32，ANP32）是一類進化高度保守的酸性核磷蛋白家族，其成員包括ANP32A、ANP32B和ANP32E，一般含有220～290個氨基酸，分子量約32 kD。ANP32家族蛋白成員間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，N端為富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域（Leucine-rich repeats，LRR），以LRR串聯(lián)陣列的形式存在，為蛋白的相互作用提供了框架；C端為低復(fù)雜性的酸性區(qū)域（Low complexity acidic region，LCAR），約由100個氨基酸組成，其中天冬氨酸和谷氨酸占60%～75%，由于LCAR結(jié)構(gòu)缺乏疏水性氨基酸而影響三級結(jié)構(gòu)的形成，致使該結(jié)構(gòu)是以游離的形式存在，從而具有與帶正電荷蛋白發(fā)生相互作用的能力（Matilla and Radrizzani，2005；de Chiara et al.，2008；Reilly et al.，2014）。ANP32家族蛋白具有多種生物學(xué)功能，如抑制蛋白磷酸化（Habrukowich et al.，2010）、染色體修飾和重構(gòu)（Tochio et al.，2010；Obri et al.，2014）、細胞凋亡調(diào)控（Shen et al.，2010）和病毒復(fù)制（Long et al.，2016），以及細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運（Fries et al.，2007）等。因此，開展雞ANP32家族蛋白亞細胞定位及其在免疫器官中的表達特征分析，可為后續(xù)探討雞ANP32家族蛋白在相關(guān)病毒復(fù)制中的作用機理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】ANP32A基因于1994年首次被克?。╒aesen et al.，1994），隨后研究人員基于氨基酸序列相似性、進化保守性和結(jié)構(gòu)相似性定義了ANP32家族其他蛋白成員（Matilla and Radrizzani，2005）。ANP32家族蛋白具有磷酸酶活性，其中ANP32A能有效抑制蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A，PP2A）（Li et al.，1996），可與鞘氨醇相互作用以調(diào)節(jié)人類內(nèi)皮細胞中的PP2A活性及環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達，進而影響細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)（Habrukowich et al.，2010）。此外，ANP32A能與突變的人類共濟失調(diào)蛋白1（Ataxin-1）結(jié)合而調(diào)節(jié)PP2A活性（Sánchez et al.，2013），ANP32E也可抑制PP2A活性（Costanzo et al.，2006），但ANP32B不具備此功能（Sun et al.，2006）。ANP32家族具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并影響轉(zhuǎn)錄過程的功能，其中，ANP32A主要通過電荷作用與組蛋白H3的N末端結(jié)合而影響組蛋白H3修飾，進而抑制其乙?；^程（Schneider et al.，2004）；ANP32B與Krüppel樣因子5（Krüppel-like factor 5，KLF5）直接相互作用，且被KLF5招募至啟動子區(qū)域，阻止組蛋白乙?；?，進而抑制轉(zhuǎn)錄過程（Munemasa et al.，2008）；ANP32E能解離由DNA和組蛋白變體H2A.Z（Histone variant H2A.Z，H2A.Z）形成的非核小體聚集體，因此H2A.Z蛋白可結(jié)合在特定的DNA轉(zhuǎn)錄位點而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程（Mao et al.，2014）。ANP32家族蛋白還具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的功能，ANP32A和ANP32B作為mRNA結(jié)合蛋白HuR與核輸出受體CRM1間的銜接成分，調(diào)節(jié)富含腺苷酸元素的mRNA轉(zhuǎn)運（Brennan et al.，2000）。ANP32家族蛋白在病毒的復(fù)制中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ANP32A和ANP32B蛋白是A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）復(fù)制及其聚合酶活性的決定性宿主因子，ANP32E蛋白不能支持IAV復(fù)制，但解析了IAV跨物種傳播的分子機制（Zhang et al.，2019，2020）；ANP32家族蛋白也是B型流感病毒（Influenza B virus，IBV）聚合酶活性的關(guān)鍵性宿主蛋白，哺乳動物的ANP32A和ANP32B蛋白可單獨支持IBV復(fù)制，而ANP32E蛋白只起到一定的支持作用，揭示了禽類ANP32家族蛋白無法有效支持IBV聚合酶活性的分子機制（Zhang et al.，2020）。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ANP32A和ANP32B蛋白對人類艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的復(fù)制起關(guān)鍵作用，且ANP32A、ANP32B蛋白分別與CRM1和Rev發(fā)生相互作用而介導(dǎo)HIV未完全剪切RNA的核輸出（Wang et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)ANP32家族蛋白的生物學(xué)功能研究主要集中在人類和小鼠上，針對其他物種的研究相對較少。雞ANP32B蛋白能與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）M蛋白發(fā)生相互作用，并促進M蛋白在細胞核的聚集（Günther et al.，2020），但雞ANP32家族蛋白的亞細胞定位、在免疫器官（脾臟、胸腺和法氏囊）中的表達特征及調(diào)控NDV復(fù)制的作用機制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)GenBank已公布的雞ANP32家族蛋白基因序列構(gòu)建其重組真核表達載體，轉(zhuǎn)染細胞后進行融合蛋白表達和亞細胞定位分析，并采用實時熒光定量PCR檢測分析ANP32家族蛋白基因在不同月齡雞免疫器官中的表達特征，為后續(xù)研究雞ANP32家族蛋白與NDV復(fù)制及其致病性的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貴州瑤山雞來自貴州大學(xué)種雞場，在相同條件下進行飼養(yǎng)，隨機選取1～6月齡的雞各3羽，分別采集其免疫器官（脾臟、胸腺和法氏囊）置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。真核表達載體pEGFP-C1、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、雞胚成纖維細胞（DF-1）、人胚胎腎細胞（HEK-293T）由貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存提供；2×EsTaqMasterMix（Dye）、抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG（H+L）和HRP購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Total RNA Kit II R6934試劑盒、Gel Extraction Kit試劑盒及Endo-free Plasmid Mini Kit II試劑盒購自O(shè)MEGA公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（XhoI、KpnI、EcoR I和BamH I）和TurboFect Transfection Reagent 購自Thermo Fisher公司；RIPA細胞裂解液（弱）和增強型ECL顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；StarScript II反轉(zhuǎn)錄試劑和5×SDS-PAGE上樣緩沖液購自GenStar公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix購自APExBIO公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已公布的雞ANP32A基因序列（XM_040680256.1）、ANP32B基因序列（NM_0010 30934.1）、ANP32E基因序列（NM_001006564.2），使用Primer Premier 5.0設(shè)計擴增雞ANP32A、ANP32B和ANP32E基因編碼區(qū)（CDS）的PCR擴增引物及檢測其表達水平的實時熒光定量PCR擴增引物，以β-actin為內(nèi)參基因。所有引物（表1）均委托重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴增和實時熒光定量PCR擴增引物信息Table 1 The primer information of PCR amplification and real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 雞ANP32家族基因重組真核表達載體構(gòu)建

提取DF-1細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用特異性引物分別擴增雞ANP32家族基因CDS序列。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×EsTaqMasterMix（Dye）10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，然后將其與真核表達載體pEGFP-C1分別進行雙酶切，再次膠回收后進行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落擴大培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定，然后提取陽性菌液質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，并將鑒定正確的陽性質(zhì)粒送至重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司測序。

1.4 融合蛋白表達檢測

將HEK-293T細胞接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入15%胎牛血清培養(yǎng)基，控制細胞初始接種密度為50%，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達70%～90%時以TurboFect Transfection Reagent將重組真核表達載體和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞。轉(zhuǎn)染36 h后，采用RIPA細胞裂解液（弱）進行裂解，4 ℃離心收集上清液，加入適量上樣緩沖液煮沸后進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。使用5%脫脂乳于37 ℃下將PVDF膜封閉2 h，加入1∶1500稀釋的抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體4 ℃孵育16 h；TBST洗3次，再加入1∶2000稀釋的山羊抗小鼠IgG（H+L）37 ℃孵育2 h；TBST洗3次，使用增強型ECL顯色劑進行顯色。

1.5 融合蛋白亞細胞定位分析

按照1.4的方法，將重組真核表達載體和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，轉(zhuǎn)染36 h后以PBS洗滌3次，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗滌3次，加入0.25%TritonX-100室溫作用5 min；PBS洗滌3次，再加入DAPI進行細胞核染色；PBS洗滌3次，將細胞置于正置熒光顯微鏡下采集熒光照片。熒光照片采用Photoshop進行Merge處理，根據(jù)融合蛋白熒光與細胞核熒光的重疊情況，判斷融合蛋白的亞細胞定位情況。

1.6 實時熒光定量PCR檢測雞ANP32家族基因表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測ANP32家族基因在1、2、3、4、5和6月齡雞免疫器官中的表達情況，以β-actin為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，ROX染料0.4 μL，ddH2O 7.6 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃15 s，退火40 s，72 ℃30 s，進行40個循環(huán)。熔解曲線程序為儀器默認(rèn)設(shè)置，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行處理，以6月齡脾臟為對照，通過2-ΔΔCt法計算雞ANP32家族基因相對表達量，并以SPSS 25.0進行單因素方差分析（Oneway ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞ANP32家族基因重組真核表達載體鑒定結(jié)果

以DF-1細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用特異性引物擴增雞ANP32家族基因CDS序列，電泳檢測結(jié)果顯示擴增獲得的目的基因片段大?。▓D1）與預(yù)期結(jié)果相符。對構(gòu)建的重組真核表達載體進行單酶切和雙酶切鑒定，結(jié)果表明，重組真核表達載體pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E經(jīng)單酶切后均得到約5500 bp的載體條帶，而經(jīng)雙酶切后獲得4700 bp的載體條帶及與預(yù)期結(jié)果相符的目的基因條帶（圖2）。測序結(jié)果表明，雞ANP32A、ANP32B和ANP32E基因均正確插入到真核表達載體pEGFP-C1的多克隆位點區(qū)域，且未發(fā)生基因突變和開放閱讀框移碼，即重組真核表達載體構(gòu)建成功。

圖1 雞ANP32家族基因CDS序列PCR擴增電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of chicken ANP32 family gene CDS sequence

圖2 雞ANP32家族基因重組真核表達載體酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant eukaryotic expression vector of chicken ANP32 family gene

2.2 雞ANP32家族基因融合蛋白表達分析結(jié)果

為檢測構(gòu)建的雞ANP32家族基因重組真核表達載體在細胞中是否正確表達，將空載體pEGFP-C1和重組真核表達載體（pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E）分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞并進行Western blotting檢測。結(jié)果顯示：在細胞中誘導(dǎo)表達的標(biāo)簽蛋白EGFP及融合蛋白EGFPANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E，經(jīng)Western blotting檢測均得到與預(yù)期結(jié)果相符的蛋白條帶（圖3），從左到右蛋白大小依次為28.0、60.0、57.9和56.9 kD，對應(yīng)的融合蛋白ANP32A、ANP32B、ANP32E分子量分別為32.0、29.9和28.9 kD。說明雞ANP32家族基因融合蛋白在HEK-293T細胞中正確表達。

圖3 雞ANP32家族基因融合蛋白Western blotting檢測結(jié)果Fig.3 Western blotting results of chicken ANP32 family gene fusion proteins1：標(biāo)簽蛋白EGFP；2：融合蛋白EGFP-ANP32A；3：融合蛋白EGFPANP32B；4：融合蛋白EGFP-ANP32E1：Tag protein EGFP；2：Fusion protein EGFP-ANP32A；3：Fusion protein EGFP-ANP32B；4：Fusion protein EGFP-ANP32E

2.3 雞ANP32家族基因融合蛋白亞細胞定位分析結(jié)果

為確定雞ANP32家族基因融合蛋白亞細胞定位情況，將空載體pEGFP-C1和重組真核表達載體（pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E）分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，經(jīng)細胞固定、破膜及細胞核染色后進行熒光觀察。結(jié)果（圖4）顯示：標(biāo)簽蛋白EGFP呈綠色，其細胞核呈藍色，二者的熒光不完全重合，因此標(biāo)簽蛋白EGFP定位在細胞核和細胞質(zhì)；而融合蛋白EGFPANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的熒光與細胞核熒光完全重合，即主要定位在細胞核。

圖4 雞ANP32家族基因融合蛋白亞細胞定位分析結(jié)果（100×）Fig.4 Subcellular localization analysis of fusion proteins of chicken ANP32 family genes（100×）

2.4 ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官中的表達特征

2.4.1ANP32A基因在不同月齡雞免疫器官中的表達特征 如圖5所示，ANP32A基因在1～6月齡雞免疫器官中均有表達，且在不同免疫器官中的表達水平存在差異。ANP32A基因在不同月齡雞脾臟、胸腺和法氏囊中的相對表達量整體上均呈先上升后下降的變化趨勢，且以2月齡雞免疫器官中的相對表達量最高。其中，2月齡雞脾臟中的ANP32A基因相對表達量比3月齡極顯著提高1.6倍（P＜0.01，下同），比4～6月齡極顯著提高6.9～10.9 倍；2 月齡雞胸腺中的ANP32A基因相對表達量比1月齡極顯著提高1.6倍，比3月齡極顯著提高2.6倍，比4～6月齡極顯著提高8.3～18.8倍；2月齡雞法氏囊中的ANP32A基因相對表達量比1月齡極顯著提高3.4倍，比3～6月齡極顯著提高5.3～14.5倍。

圖5 ANP32A基因在1～6月齡雞免疫器官中的表達特征Fig.5 Expression analysis of ANP32A gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

2.4.2ANP32B基因在不同月齡雞免疫器官中的表達特征 如圖6所示，ANP32B基因在1～6月齡雞免疫器官中均有表達，且在不同免疫器官中的表達水平存在差異。ANP32B基因在不同月齡雞脾臟、胸腺和法氏囊中的相對表達量整體上呈逐漸下降的變化趨勢。其中，1月齡雞脾臟中的ANP32B基因相對表達量比2月齡極顯著提高1.7倍，比3～4月齡極顯著提高3.5～3.6倍，比5～6月齡極顯著提高14.4～16.8倍；1月齡雞胸腺中的ANP32B基因相對表達量比3月齡極顯著提高2.2倍，比4～6月齡極顯著提高4.9～31.3倍；1月齡雞法氏囊中的ANP32B基因相對表達量比2月齡極顯著提高2.8倍，比3～6月齡極顯著提高9.4～20.1倍。

圖6 雞ANP32B基因在1～6月齡免疫器官中的表達特征Fig.6 Expression analysis of ANP32B gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

2.4.3ANP32E基因在雞不同月齡免疫器官中的表達特征 如圖7所示，ANP32E基因在1～6月齡雞免疫器官中也均有表達，且在不同免疫器官中的表達水平存在差異。ANP32E基因在不同月齡雞脾臟和法氏囊中的相對表達量整體上呈先上升后下降的變化趨勢，均以2月齡雞免疫器官中的相對表達量最高，而在不同月齡雞胸腺中的相對表達量整體上呈逐漸下降趨勢。其中，2月齡雞脾臟中的ANP32E基因相對表達量比4月齡極顯著提高3.4倍，比1月齡和3月齡極顯著提高5.4和5.6倍，比5～6月齡極顯著提高54.7～61.9倍；1月齡雞胸腺中的ANP32E基因相對表達量比2～4月齡極顯著提高2.3～4.8倍，比5～6月齡極顯著提高28.8～31.7倍；2月齡雞法氏囊中的ANP32E基因相對表達量比1月齡極顯著提高1.7倍，比3～6月齡極顯著提高21.2～132.4倍。

圖7 雞ANP32E基因在1～6月齡免疫器官中的表達特征Fig.7 Expression analysis of ANP32E gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

3 討論

ANP32家族蛋白成員共有5個，分別是ANP32A、ANP32B、ANP32C、ANP32D和ANP32E，由于ANP32C和ANP32D是由內(nèi)含子編碼通常被認(rèn)為是假基因，因此對該家族蛋白的研究主要集中在ANP32A、ANP32B和ANP32E（Matilla and Radrizzani，2005）。ANP32家族蛋白成員間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，其C端第246～260位氨基酸間包含特定的核定位信號KRKR，介導(dǎo)其完成入核轉(zhuǎn)運（Matsubae et al.，2000）；而N端的LCAR結(jié)構(gòu)與核輸出蛋白CRM1相互作用，介導(dǎo)其完成出核轉(zhuǎn)運，即ANP32家族蛋白是一種細胞核—細胞質(zhì)穿梭蛋白。在ANP32家族蛋白核質(zhì)穿梭功能研究方面，Opal等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，ANP32A在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達且其細胞定位與神經(jīng)元分化存在一定關(guān)聯(lián)，即在神經(jīng)元軸突形成過程中ANP32A從細胞核遷移至細胞質(zhì)，而在未分化的小鼠腦神經(jīng)母細胞瘤細胞（neuro-2a）中ANP32A主要定位于細胞核，分化后則分布于細胞質(zhì)和軸突。此外，ANP32A作為細胞凋亡增強因子，可通過刺激凋亡小體而激活Caspase，在細胞凋亡過程中從細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)（Pan et al.，2009）。ANP32B在G1期和S期特異性表達，且在S期聚集在細胞核中（Sun et al.，2001）。劉思瑤（2021）研究表明，ANP32B在乳腺癌MCF7細胞分裂間期主要定位于細胞核，在分裂期則彌散性分布于細胞質(zhì)。關(guān)于ANP32E的細胞定位至今未見相關(guān)報道。本研究通過構(gòu)建雞ANP32家族基因重組真核表達載體并轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，誘導(dǎo)表達獲得的融合蛋白ANP32A、ANP32B和ANP32E主要定位于細胞核，該結(jié)了為進一步研究雞ANP32家族蛋白細胞核定位的分子機制及組織內(nèi)定位功能研究打下了基礎(chǔ)。

ANP32家族蛋白在人類和小鼠的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。ANP32A在腦組織中的表達最豐富，且在成人腦組織不同區(qū)域的分布存在顯著差異，在小腦、顳葉和大腦皮層呈高表達，而在腦橋、延髓和脊髓呈低表達；且在成年大腦的表達水平高于幼年（Wang et al.，2015）。因此，ANP32A基因在大腦組織中的分布及表達水平提示著ANP32A可能在哺乳動物大腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，ANP32A基因在小鼠的心臟、肝臟、脾臟和肺臟組織中均有表達，但幼齡小鼠的表達量顯著低于成年小鼠，即ANP32A基因在組織中的表達差異與年齡有關(guān)（王躍群，2016）。有關(guān)ANP32B和ANP32E的組織表達特征研究表明，ANP32B基因在小鼠免疫器官（脾臟、胸腺）中的表達水平高于腦組織（Reilly et al.，2011）；ANP32E基因中在小鼠小腦中高表達，且在小鼠出生后第7 d的相對表達量最高，在成熟小鼠小腦中不表達（Radrizzani et al.，2001）。本研究對ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官（脾臟、胸腺、法氏囊）中的表達水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANP32家族基因在雞不同免疫器官中均有表達，但ANP32A和ANP32E基因在1～6月齡雞免疫器官中呈先上升后下降的表達趨勢，且在2月齡免疫器官中的相對表達量達峰值；ANP32B基因的表達則呈下降趨勢?？梢?，ANP32家族基因在雞免疫器官中具有獨特的表達特征，其表達差異與免疫器官發(fā)育及免疫功能間的關(guān)系有待進一步探究。

近年來，ANP32家族蛋白除了具有在細胞內(nèi)的已知生物學(xué)功能外，大量研究還發(fā)現(xiàn)其與病毒復(fù)制存在聯(lián)系（Wang et al.，2019；Zhang et al.，2019，2020）。ANP32A和ANP32B能與流感病毒聚合酶RdRP三亞基聚合體發(fā)生相互作用，促進流感病毒感染細胞后的cRNA-vRNA合成（Sugiyama et al.，2015）。此外，ANP32B蛋白能與NDV、尼帕病毒及仙臺病毒等副黏病毒M蛋白發(fā)生相互作用，促進M蛋白在細胞核中的積累，即在副黏病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用（Duan et al.，2020；Günther et al.，2020）。鑒于ANP32家族蛋白成員能參與調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，其在家禽相關(guān)病毒如禽流感病毒和NDV復(fù)制中的作用機制值得深入研究。因此，今后應(yīng)對NDV感染后雞免疫器官中的ANP32家族基因表達水平進行監(jiān)測，并從細胞水平深入解析其調(diào)控NDV復(fù)制的作用機制，為后續(xù)開展NDV致病分子機制打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

雞ANP32家族蛋白主要定位于細胞核，且ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官中均有表達，但這3個基因具有獨特的表達特征，其表達差異與免疫器官發(fā)育及免疫功能間的關(guān)系有待進一步探究。