高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子DFI差異分析

楊凱琳，胡家豪，司景磊，陳獻(xiàn)欣，鄭啟源，田 奎，張 浪，陸陽清*，許常龍

（1廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530300；3南寧市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)療中心，廣西 南寧 530031）

0 引言

【研究意義】目前大部分種豬場采用人工授精（Artificial insemination，AI）進(jìn)行配種，旨在充分發(fā)揮種公豬的使用效率。種公豬精液品質(zhì)直接影響其繁殖性能及與配母豬的產(chǎn)仔數(shù)量和質(zhì)量，與豬場的經(jīng)濟(jì)效益緊密相關(guān)（王洋等，2019）。在實際生產(chǎn)中，精液的常規(guī)參數(shù)（采精量、精子密度和精子活力等）只能對公豬精液品質(zhì)及其繁殖力進(jìn)行部分評估（Myromslien et al.，2019），人工授精所用精液品質(zhì)評估不全面，通常會導(dǎo)致與配母豬的產(chǎn)仔率降低，而畸胎率和死胎率升高。因此，嚴(yán)格篩選優(yōu)質(zhì)的公豬精液對提高母豬活產(chǎn)仔數(shù)及保障豬場經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】為全面評估精子質(zhì)量，精子DNA碎片檢測等手段為深度評估種公豬繁殖力提供了技術(shù)支撐。精子DNA碎片是由精子DNA損傷引起（Sakkas and Alvarez，2010），通常以精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）表示精子DNA完整性，高DFI表明染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常（Evenson and Jost，2000）。據(jù)報道，精子DNA完整性降低會對精子質(zhì)量和胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響（McQueen et al.，2019；Mateo-Otero et al.，2022）。目前，分析精子DNA完整性最常用的方法有缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）及精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗（SCD）（Sakkas and Alvarez，2010）。SCSA可通過流式細(xì)胞術(shù)評估精子DNA碎片化（Evenson et al.，1994），其原理是利用吖啶橙（AO）染料的異染性，與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合時發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合時發(fā)出紅色熒光。SCSA已廣泛應(yīng)用于不同物種的精子質(zhì)量評估，對物種繁育情況具有較高的評估潛力。Love（2005）研究認(rèn)為，在相同精液儲存條件下，低繁殖力種馬精子DNA碎片率升高的速度較高繁殖力種馬快；Tsakmakidis等（2012）的研究結(jié)果表明，青年公豬的精子DNA不穩(wěn)定性顯著高于成年公豬，但與老年公豬無顯著差異；Bielas等（2017）研究發(fā)現(xiàn)波蘭大白公豬的精子DFI與精子活率及活力呈負(fù)相關(guān)；Morrell等（2018）對肉牛和奶牛的精子進(jìn)行質(zhì)量評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶牛精子DNA完整性高于肉牛?！颈狙芯壳腥朦c】精子DFI檢測作為進(jìn)一步評估精液品質(zhì)的補(bǔ)充方法，能有效預(yù)測種公豬的繁殖潛力，但至今鮮見針對長白公豬繁殖力與精子DFI相關(guān)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高繁殖力和低繁殖力的法系長白種公豬為研究對象，統(tǒng)計分析其與配母豬的繁育數(shù)據(jù)，利用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）對精液品質(zhì)進(jìn)行常規(guī)參數(shù)評估分析，并對精子DNA碎片進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析不同產(chǎn)仔數(shù)的公豬精子DFI差異，為篩選出高繁殖力種公豬提供參考依據(jù)，進(jìn)而優(yōu)化豬場人工授精工作及提高種豬場的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的12頭種公豬均來自廣西南寧種豬場，為具有完整繁育記錄的法系長白公豬（23～40月齡）。每頭種公豬隔4～6 d采精1次，固定采精時間及采精員。繁育數(shù)據(jù)分析所選每頭種公豬與配母豬的配種分區(qū)、配種舍及配種方式保持一致，且保證單一公豬配種，公豬和母豬的健康狀況良好。主要儀器設(shè)備及試劑耗材：光學(xué)顯微鏡和精子分析儀購自MOFA公司，恒溫箱購自北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司，流式細(xì)胞儀（CytoFLEX）購自美國Beckman Coulter公司，采精袋和一次性精子計數(shù)玻片購自德國Minitube公司，全能健豬精液稀釋粉購自日本ZENOAQ公司，精子核完整性染色試劑盒購自浙江星博生物科技股份有限公司，活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 公豬精液采集與稀釋 公豬精液樣本通過假母臺法采取，并以采精袋收集，讓精液自然流過濾網(wǎng)，棄上層過濾袋，然后在精液袋貼上公豬ID及采精員標(biāo)簽，即完成原精液采集。根據(jù)采精量、精子密度等計算稀釋頭份（30億精子/80 mL），按稀釋頭份將稀釋液沿著盛放精液的杯子內(nèi)壁緩慢注入，并輕輕攪拌均勻。稀釋好的精液降溫2 h后，置于17 ℃恒溫箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精液品質(zhì)檢測 吸取2.5 μL稀釋精液樣本加入到精子計數(shù)玻片的點樣區(qū)域，通過CASA對公豬精液品質(zhì)進(jìn)行檢測分析，包括采精量、精子密度、精子活力、精子畸形率及精子運動參數(shù)等。

1.2.3 精子DFI測定 利用SCSA對精子DFI進(jìn)行測定，首先向稀釋好的精液中加入100 μL精子核完整性染色試劑盒中的A液，稀釋至1×106精子/mL，然后加入200 μL B液反應(yīng)30 s，最后加入600 μL C液進(jìn)行染色處理，孵育5 min后上流式細(xì)胞儀檢測。采集FITC和PC5.5通道的熒光信號，分別代表dsDNA（綠色）和ssDNA（紅色）的熒光強(qiáng)度，DFI以紅色/（紅色+綠色）的熒光比百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.4 精子活性氧（ROS）測定 先取適量稀釋好的精液樣本進(jìn)行離心處理（400×g，10 min），棄上清液，保留精子細(xì)胞沉淀；然后加入適量PBS，稀釋至1×106精子/mL，離心（600×g，5 min）洗滌精子，收集精子細(xì)胞沉淀。吸取1 μL DCFH-DA探針加入1 mL PBS進(jìn)行稀釋，37 ℃孵育20 min后以PBS洗滌（600×g離心3 min）3次。精子中的ROS能將無熒光的DCFH氧化成具有綠色熒光的DCF，因此可通過流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光精子細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并通過t檢驗進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 高繁殖力和低繁殖力長白公豬繁育性能分析結(jié)果

為區(qū)分高繁殖力和低繁殖力公豬，選取12頭法系長白公豬，對與配母豬繁育數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，平均窩產(chǎn)仔數(shù)高于13.50頭判定為高繁殖力公豬，平均窩產(chǎn)仔數(shù)低于13.50頭則為低繁殖力公豬，確定高繁殖力組和低繁殖力組公豬各6頭。表1為高繁殖力和低繁殖力長白公豬的具體繁育數(shù)據(jù)。如圖1所示，高繁殖力公豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和活產(chǎn)仔數(shù)均極顯著高于低繁殖力公豬（P＜0.01，下同），但二者的畸胎數(shù)和死胎數(shù)差異不顯著（P＞0.05，下同）。

圖1 高繁殖力和低繁殖力長白公豬繁育性能的比較Fig.1 Reproductive data analysis and statistics of Landrace boars with high and low reproductive performance

表1 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的繁育數(shù)據(jù)Table 1 Reproductive data of Landrace boars with high and low reproductive performance

2.2 高繁殖力和低繁殖力長白公豬精液品質(zhì)分析結(jié)果

為了比較高繁殖力和低繁殖力公豬的精液品質(zhì)，對12頭供試長白公豬各采精35次，通過CASA對其精液品質(zhì)進(jìn)行分析。由圖2可看出，高繁殖力公豬的精子運動擺尾幅度較低繁殖力公豬精子的大。在采精量、精子密度和精子活力方面，高繁殖力公豬與低繁殖力公豬間的差異均不顯著（表2），但高繁殖力公豬精子的前進(jìn)運動率顯著高于低繁殖力公豬精子（89.86±3.11 vs 78.10±3.85）（P＜0.05，下同），且低繁殖力公豬精子畸形率極顯著高于高繁殖力公豬（0.12±0.01 vs 0.08±0.01）。

圖2 高繁殖力和低繁殖力長白公豬精子的CASA分析圖像Fig.2 CASA analysis image of sperm of Landrace boars with high and low reproductive performance

2.3 高繁殖力和低繁殖力長白公豬精子畸形參數(shù)分析結(jié)果

由表2已知低繁殖力公豬精子畸形率極顯著高于高繁殖力公豬，為進(jìn)一步明確二者間的精子畸形差異，對其畸形參數(shù)進(jìn)行比較分析，但結(jié)果（表3）顯示高繁殖力和低繁殖力公豬精子在近端原生質(zhì)滴率、遠(yuǎn)端原生質(zhì)滴率及折尾率等方面的差異均不顯著。

表2 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精液品質(zhì)比較Table 2 Semen quality comparison of Landrace boars with high and low reproductive performance

表3 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子畸形參數(shù)比較Table 3 Sperm abnormal parameters comparison of Landrace boars with high and low reproductive performance

2.4 高繁殖力和低繁殖力長白公豬精子運動參數(shù)分析結(jié)果

通過CASA分析得到高繁殖力和低繁殖力公豬的精子運動參數(shù)（表4），除了高繁殖力公豬精子的曲線速率（VCL）顯著高于低繁殖力公豬（131.10±3.79 vs 116.10±4.12）外，其他的運動參數(shù)均無顯著差異。

表4 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子運動參數(shù)比較Table 4 Sperm motility parameters comparison of Landrace boars with high and low reproductive performance

2.5 高繁殖力和低繁殖力長白公豬精子DFI與ROS水平差異分析結(jié)果

為了比較高繁殖力和低繁殖力公豬的精子DFI差異，采用染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測長白公豬精子DFI，結(jié)果（表5和圖3）顯示，高繁殖力公豬的精子DFI極顯著低于低繁殖力公豬（0.80±0.04 vs 1.65±0.12）。同時通過流式細(xì)胞儀對精子細(xì)胞進(jìn)行DCF熒光強(qiáng)度檢測，對比分析高繁殖力和低繁殖力公豬精子ROS水平差異，結(jié)果（表5和圖4）顯示，高繁殖力公豬的精子ROS水平也極顯著低于低繁殖力公豬（1.00±0.08 vs 2.03±0.19）。

圖3 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子DFI分析結(jié)果Fig.3 Sperm DFI data analysis of Landrace boars with high and low reproductive performance

圖4 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子ROS水平分析結(jié)果Fig.4 Sperm ROS level analysis of Landrace boars with high and low reproductive performance

表5 高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子DFI與ROS水平比較Table 5 Sperm DFI and ROS level comparison of Landrace boars with high and low reproductive performance

2.6 長白公豬產(chǎn)仔數(shù)與各精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性

長白公豬產(chǎn)仔數(shù)與各項精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果如圖5所示。公豬產(chǎn)仔數(shù)與精子DFI呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.85）、與精子畸形率（r=-0.70）和精子ROS水平（r=-0.78）呈中度負(fù)相關(guān)；公豬精子畸形率與精子DFI（r=0.63）和ROS水平（r=0.62）呈中度正相關(guān)；精子DFI與ROS水平呈高度正相關(guān)（r=0.93）。公豬日齡與精子DFI、產(chǎn)仔數(shù)不存在相關(guān)性，且其他精液質(zhì)量參數(shù)與產(chǎn)仔數(shù)間的相關(guān)性也較弱或不存在相關(guān)性。

圖5 長白公豬產(chǎn)仔數(shù)與精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性Fig.5 Correlation between litter size and semen quality parameters of Landrace boars

3 討論

評估公豬繁殖效率對于優(yōu)化種豬生產(chǎn)中的人工授精技術(shù)流程具有重要意義，而精液品質(zhì)決定了公豬的繁殖效率（Foote，2003；陳集成等，2022）。傳統(tǒng)的精液品質(zhì)檢測對評估公豬繁育性能存在一定局限性，CASA分析和精子DFI檢測能輔助傳統(tǒng)檢測技術(shù)，實現(xiàn)對公豬繁育性能進(jìn)行更全面、更客觀、更科學(xué)地評估。人工授精站通常利用CASA分析精子的各種運動特征，以提高精液品質(zhì)和精子運動力評估的準(zhǔn)確性和客觀性（Kummer et al.，2013）。其中，VCL和平均路徑速率（VAP）等參數(shù)能有效反映精子活力，精子的運動速度分級主要由VCL決定。本研究結(jié)果顯示，高繁殖力長白公豬精子的VCL顯著高于低繁殖力長白公豬，二者的精子活力雖然無顯著差異，但呈現(xiàn)精子活力越高其產(chǎn)仔數(shù)越多的變化趨勢，與張軍榮等（2015）的研究結(jié)果一致，即VCL與精子活力密切相關(guān)。

DNA是精子遺傳信息的重要載體，主要位于精子頭部，部分位于線粒體鞘，若精子DNA受損傷則導(dǎo)致精子功能缺陷。本研究結(jié)果表明，高繁殖力和低繁殖力長白公豬的精子DFI均處于較低水平（0.70%～2.22%），平均為1.18%，與Batista等（2016）、Bielas等（2017）的研究結(jié)果基本一致，即公豬精子DFI均低于5%。由于現(xiàn)有的研究尚未對公豬精子DFI進(jìn)行閾值劃定，因此本研究僅依據(jù)高、低繁殖力公豬的精子DFI數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，二者間存在顯著差異。Bungum等（2007）曾研究報道，精子DNA損傷會改變精子的運動及形態(tài)。本研究對長白公豬精子DFI與精液品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果表明，公豬精子畸形率與精子DFI呈中度正相關(guān)（r=0.63），與黃學(xué)鋒等（2010）、孫超等（2011）、龔道元等（2012）的研究結(jié)果基本一致，即精子DFI與正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)。

精子DNA受損最終導(dǎo)致受精率下降和雄性不育（譚艷和范立青，2017）。本研究通過分析高繁殖力和低繁殖力長白公豬的繁育性能和精子DFI，以評估精子DFI對公豬繁殖力的影響，結(jié)果表明，低精子DFI公豬與配母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)為14.10頭、平均活產(chǎn)仔數(shù)為13.11頭，分別顯著高于高精子DFI公豬與配母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)（12.93頭）和平均活產(chǎn)仔數(shù)（11.88頭）；相關(guān)分析結(jié)果也顯示長白公豬產(chǎn)仔數(shù)與精子DFI呈高度負(fù)相關(guān)。因此，推測公豬精子DNA損傷會導(dǎo)致與配母豬的產(chǎn)仔數(shù)下降，與Mateo-Otero等（2022）的研究結(jié)果一致。Boe-Hansen等（2008）對漢普夏豬、丹麥大白豬和長白豬的研究發(fā)現(xiàn)，精子DFI＜1.5%及1.5%＜DFI＜3.0%的公豬產(chǎn)仔數(shù)明顯高于精子DFI＞3.0%的公豬，接近于每窩減少1頭仔豬的差異，其產(chǎn)仔數(shù)差異對豬場經(jīng)濟(jì)效益影響顯著。

目前，有關(guān)精子DNA損傷的產(chǎn)生機(jī)制主要有3種：組蛋白—魚精蛋白轉(zhuǎn)變失敗、氧化應(yīng)激和細(xì)胞異常凋亡。其中，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致精子DNA損傷的主要原因，過量的ROS會導(dǎo)致氧化還原失衡，造成DNA單鏈或雙鏈斷裂（Muratori et al.，2015）。Barroso等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，DNA片段化與ROS的產(chǎn)生呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果也表明，精子DFI與ROS水平呈高度正相關(guān)（r=0.93），且低精子DFI的公豬精子ROS水平顯著低于高精子DFI的公豬，即氧化應(yīng)激導(dǎo)致精子DNA損傷。Ren等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在公豬冷凍精液中加入抗氧化劑NR1能減少ROS產(chǎn)生，提高公豬精子質(zhì)量及產(chǎn)仔率。Rodríguez-Tobón等（2021）評估谷胱甘肽（GSH）作為抗氧化劑對公豬精子及體外受精后胚胎發(fā)育的作用，結(jié)果表明，低濃度GSH可平衡ROS的產(chǎn)生，防止因過多ROS而降低精子活力和破壞頂體完整性，有效提高囊胚率。本研究也發(fā)現(xiàn)，高繁殖力公豬的精子ROS水平極顯著低于低繁殖力公豬，結(jié)合精子DFI與ROS水平呈正相關(guān)的結(jié)論，可以確定精子ROS水平過高會導(dǎo)致公豬精子DFI升高，進(jìn)而降低公豬產(chǎn)仔率。

4 結(jié)論

精子DNA碎片化與公豬繁殖力密切相關(guān)，即精子DFI可為評估公豬精液品質(zhì)及繁殖力提供重要參考依據(jù)。因此，在篩選種公豬時精子DFI檢測可作為公豬精子質(zhì)量評估的補(bǔ)充手段，以協(xié)同人工授精技術(shù)提高受精率及豬場經(jīng)濟(jì)效益，進(jìn)而推動養(yǎng)豬業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。