馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及其對馬鈴薯塊莖蛾的毒力研究

楊金睿，吉 澤，李俊逸，姚 遙，祝春月，王文倩，肖關(guān)麗*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是我國第四大糧食作物，除自然資源條件外，蟲害是制約我國馬鈴薯單產(chǎn)進(jìn)一步提升的重要因素（徐進(jìn)等，2019）。馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，對馬鈴薯植株和塊莖均有危害，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，已在我國南方馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)大范圍發(fā)生，尤其是在云南等地發(fā)生嚴(yán)重（閆俊杰等，2019）。在我國大力推進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的今天，為促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，采取以微生物等為基礎(chǔ)的綠色生物防治技術(shù)是馬鈴薯塊莖蛾防控的重要舉措。植物內(nèi)生細(xì)菌作為一種新型微生物資源，其豐富的微生物種類為尋找新型抗蟲微生物及其活性物質(zhì)提供了可能。因此，從不同馬鈴薯品種中探尋對馬鈴薯塊莖蛾有防治作用的內(nèi)生細(xì)菌具有重要的研究開發(fā)價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指生長在植物各種不同組織內(nèi)部但又不會引起植物表觀癥狀的微生物（Sturz et al.，2000），主要包括內(nèi)生細(xì)菌、放線菌以及真菌3大類，普遍存在于不同的植物中（張鑫，2018），在植物不同組織及其器官內(nèi)廣泛分布（賈顏等，2021）。當(dāng)前文獻(xiàn)報道的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌研究大多集中在馬鈴薯塊莖方面，研究人員通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測序發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等（屈青松等，2016；戴超，2017；Liu et al.，2020；Shi et al.，2021）。在馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌功能的研究中，研究人員通過內(nèi)生細(xì)菌菌懸液浸泡馬鈴薯種薯塊莖后，根據(jù)其生長狀況篩選出對馬鈴薯植株生長發(fā)育或致病產(chǎn)生影響的菌株（Istifadah et al.，2018）；也有采用平板培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)對馬鈴薯病原真菌有高抑制率的芽孢桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌——萎縮芽胞桿菌（B.atrophaeus）和貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）（陳星伊等，2020），而關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌防治馬鈴薯塊莖蛾的研究則鮮有報道。微生物防治已成為近年來綠色防控馬鈴薯塊莖蛾的研究熱點，如蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）已被應(yīng)用于防治馬鈴薯塊莖蛾，B.thuringiensisssp.Kurstaki（Btk）是一株商用蘇云金桿菌菌株，可制成可濕性粉劑作為化學(xué)殺蟲劑的替代品，在馬鈴薯收獲前施用以抵御馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在田間對塊莖的侵害，降低儲藏過程中塊莖被侵染的風(fēng)險（Arthurs et al.，2008）；以浸蟲法測定球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株SD對馬鈴薯塊莖蛾1齡幼蟲的毒力作用，10 d后致死率高達(dá)98%，處理后的幼蟲產(chǎn)卵量、生長發(fā)育期和后代的凈繁殖率均顯著降低，對馬鈴薯塊莖蛾造成潛在的長期影響（Yuan et al.，2017）；采用金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）和細(xì)腳擬青霉（Paecilomyces tenuipes）的孢子懸浮液浸泡處理馬鈴薯葉片和塊莖，對取食的馬鈴薯塊莖蛾幼蟲均有殺蟲作用，還可降低成蟲羽化率和卵孵化率，其中萊氏野村菌對防治初孵幼蟲侵入馬鈴薯塊莖的效果最好（Khorrami et al.，2018）；通過浸葉法測定發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）菌株ML-1不同成分對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲均有較強(qiáng)的殺蟲活性（蘇造堂，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】目前用來防治馬鈴薯塊莖蛾的生防菌較少，對馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)利用仍處于早期階段，且尚未有通過馬鈴薯可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌防治馬鈴薯塊莖蛾的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以云南省2種馬鈴薯主栽品種麗薯6號和會-2為材料，采用LB培養(yǎng)基分離培養(yǎng)馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌，根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征和16S rDNA序列進(jìn)行種類鑒定；通過浸葉飼喂法測定內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液對馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性，以期為馬鈴薯塊莖蛾的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種：麗薯6號和會-2，由云南省曲靖市會澤縣農(nóng)技中心提供。供試蟲源：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)實驗室飼養(yǎng)繁殖的馬鈴薯塊莖蛾穩(wěn)定種群，待馬鈴薯塊莖蛾幼蟲羽化為成蟲后用直形管收集雌、雄成蟲并在封口紗布上沾10%蜂蜜水喂食后使其產(chǎn)卵，待紗布上的幼蟲孵化后用合作88馬鈴薯塊莖飼養(yǎng)至3齡，選擇大小一致、健康和具有活力的馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲作為試驗蟲源。

培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基（NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2）；LB液體培養(yǎng)基（NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2）。

主要試劑及儀器：3% NaClO溶液、吐溫-80、ddH2O、細(xì)菌通用引物、2×TaqPCR Master Mix、綠色熒光核酸染料。Mastercycler?Nexus型PCR儀和5430R型多用途高效離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、DYY-2C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、RXZ-260B-30恒溫光照培養(yǎng)箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）。

1.2 樣品采集與處理

2個馬鈴薯品種種薯為根據(jù)GB 18133—2012《馬鈴薯種薯》劃分為一級種的種薯，重量50～60 g，帶有2～3個芽眼，芽長1.0 cm左右。將2個品種的種薯栽種于花盆（直徑40 cm，高40 cm），用防蟲網(wǎng)罩住以防止害蟲危害。以含沙量高、通氣性好的沙質(zhì)土為栽培土壤，2個品種采用相同的種植管理方法，每個品種種植10盆，試驗在大棚內(nèi)進(jìn)行。馬鈴薯栽種50 d其植株生長至塊莖形成期時，2個品種均選擇長勢相同的植株中部展開復(fù)葉上的完整、健康、無病蟲害癥狀的葉片為試驗材料，5次重復(fù)，取樣后即裝入密封袋帶回實驗室分離內(nèi)生細(xì)菌。

先將2個品種采集的新鮮葉片用流水沖洗1～2 min后用無菌濾紙擦干表面，用無菌水浸泡漂洗3次，放入75%酒精浸泡1 min，再用無菌水將酒精漂洗干凈，然后把葉片放入3% NaClO溶液充分浸泡1 min后用無菌水將其漂洗，最后75%酒精浸泡30 s后用無菌水充分漂洗（楊瑞先等，2005）。取少量最后一次漂洗葉片的無菌水涂布在LB固體培養(yǎng)基作為對照，若對照培養(yǎng)基未長出菌落則證明葉片表面消毒徹底。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 采用研磨法分離內(nèi)生細(xì)菌。取1 g已表面消毒好的新鮮葉片用無菌剪刀剪碎，加入適量無菌水在無菌研缽中研磨成勻漿狀溶液，取100 μL在LB固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，設(shè)5次重復(fù)（張海龍，2014）。

1.3.2 細(xì)菌種類鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定 將葉片中分離到的細(xì)菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對純化好的菌株參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（Buchanan and Gibbons，1999）對其菌落顏色、形態(tài)等培養(yǎng)性狀進(jìn)行初步鑒定。采用革蘭氏染色法鑒定細(xì)菌顯色反應(yīng)確定革蘭氏陰陽性，并觀察其細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2.2 細(xì)菌分子鑒定 以凍溶法提取細(xì)菌菌株DNA（鄭亞強(qiáng)等，2017）。將LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)好的細(xì)菌用無菌接種環(huán)挑取少許單菌落放入裝有500 μL無菌水的無菌離心管中，震蕩儀振蕩使離心管中的菌體和無菌水充分混勻，然后將裝有菌液的離心管在液氮中冰凍10 min后取出，立即放置在漂浮盤上于沸水中水浴5 min，取出后放入離心機(jī)在12000 r/min條件下離心2 min，離心管中的上清液即為DNA模板。以細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGACTTA ACCCCAATCGC-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因，PCR反應(yīng)體系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃1 min，53 ℃1 min，72 ℃2 min，進(jìn)行32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性測定

1.4.1 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液殺蟲活性測定 以分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌為供試菌株，將已在LB固體培養(yǎng)基上純化好培養(yǎng)48 h的供試菌株分別接種于裝有100 mL無菌LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于搖床28 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h。參考楊建云等（2014）的方法測定細(xì)菌菌懸液濃度，使用分光光度計時首先以LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，然后測定培養(yǎng)24 h時各原始細(xì)菌發(fā)酵液的OD600，稀釋1×106～1×108倍后取100 μL涂布于LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細(xì)菌菌落長出后根據(jù)菌落數(shù)測定原始細(xì)菌發(fā)酵液濃度，以無菌LB液體培養(yǎng)基為空白對照，每處理3次重復(fù)。依據(jù)上述方法，測定培養(yǎng)24 h原始發(fā)酵液中細(xì)菌菌體濃度后再稀釋到1.5×105～1.5×109CFU/mL用于試驗。

采用浸葉飼喂法（蘇造堂等，2020）飼喂馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲。先將馬鈴薯植株復(fù)葉葉片在配置成不同濃度的細(xì)菌發(fā)酵液中分別浸漬30 s，將葉片取出自然風(fēng)干后放置在滅菌培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿直徑為15 cm，墊1層吸水紙），并在葉片莖稈尾部包裹濕潤脫脂棉以保持葉片水分，挑取20頭供試馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲置于葉片表面，保鮮膜封口，并扎一定數(shù)量的小孔透氣，在恒溫光照培養(yǎng)箱中28 ℃、濕度75%條件下培養(yǎng)。每株菌株發(fā)酵液不同濃度處理均設(shè)3個重復(fù)，以無菌LB液體培養(yǎng)基浸泡葉片為對照（CK）。

1.4.2 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵上清液殺蟲活性測定 細(xì)菌發(fā)酵液的制備同1.4.1，將培養(yǎng)好的供試菌株發(fā)酵液配置為菌體濃度1.5×109CFU/mL，將發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心10 min，最后用無菌注射器將上清液吸出使其通過孔徑大小為0.22 μm無菌濾膜，以獲得無菌發(fā)酵上清液（許守濤等，2018），采用浸葉飼喂法測定其對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力。

1.4.3 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌菌懸液的殺蟲活性測定將供試細(xì)菌菌株接種在LB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)2 d，用含有0.05%吐溫-80的無菌水把培養(yǎng)好的菌落沖洗于無菌三角瓶中，在搖床180 r/min條件下充分振蕩均勻（徐超等，2019），采用1.4.1方法測定菌懸液濃度，再將其配置為菌體濃度1.5×109CFU/mL，采用浸葉飼喂法測定其對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

對供試菌株測序結(jié)果用Contigexpress軟件進(jìn)行拼接、校對處理，把拼接好的16S rDNA序列提交至NCBI，查找并下載數(shù)據(jù)庫中同源性最高的部分菌株序列。采用MEGA 7.0，運(yùn)用鄰接法（Neighbour-joining）及Kimura’s 2-parameter矯正模型構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行1000次Bootstrap驗證。

用Excel 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS version 7.05的Duncan’s新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用生物測定模塊分析不同處理毒力測定數(shù)據(jù)，計算毒力回歸方程、致死中時間（LT50）和致死中濃度（LC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌分離和鑒定結(jié)果

從馬鈴薯品種麗薯6號葉片中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌，編號QL1；在28 ℃光照培養(yǎng)箱條件下經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株QL1菌落呈近似圓形，淡白色，不透明，微隆起，邊緣規(guī)則，表面干燥粗糙，革蘭氏染色陽性，菌體為桿狀（圖1-A和圖1-B），與已報道的蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）相同（胡虓等，2020）。從馬鈴薯品種會-2葉片中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌，編號YH2；在28 ℃光照培養(yǎng)箱條件下經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株YH2菌落呈圓形，橙色，不透明，隆起，邊緣規(guī)則，表面濕潤，革蘭氏染色陽性，菌體為短桿狀（圖1-C和圖1-D），與已報道的帶化紅球菌（R.fascians）相同（Radhika et al.，2015）。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌菌株QL1和YH2菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.1 Colony morphology and Gram staining of endophytic bacteria strains QL1 and YH2

將菌株QL1和YH2測序結(jié)果校對拼接后分別提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株QL1與3株蘇云金芽孢桿菌的相似性達(dá)99.79%以上，菌株YH2與2株帶化紅球菌的相似性達(dá)99.54%以上。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）可看出，菌株QL1先與3株蘇云金芽孢桿菌聚為一支，且4株菌處在同一個分支長度上，然后再與其他芽孢桿菌屬的菌株聚合，表明菌株QL1與蘇云金芽孢桿菌的親緣關(guān)系很近，結(jié)合形態(tài)特征等確定菌株QL1為厚壁菌門芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）可看出，菌株YH2先與2株帶化紅球菌聚為一支，且3株菌處在同一個分支長度上，然后再與其他紅球菌屬的菌株聚合，表明菌株YH2與帶化紅球菌的親緣關(guān)系很近，結(jié)合形態(tài)特征等確定菌株YH2為放線菌門紅球菌屬的帶化紅球菌。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株QL1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain QL1 based on 16S rDNA sequence

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株YH2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YH2 based on 16S rDNA sequences

2.2 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的殺蟲活性

2.2.1 細(xì)菌發(fā)酵液濃度 2種細(xì)菌發(fā)酵液在搖床28 ℃，180 r/mim條件下培養(yǎng)24 h后用紫外分光光度計測得菌株QL1的OD600均值為0.97，對應(yīng)涂布法濃度為1.5×109CFU/mL；菌株YH2的OD600均值為0.98，對應(yīng)涂布法濃度為1.8×109CFU/mL。

2.2.2 菌株QL1發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力 菌株QL1各濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均隨著處理時間延長而逐漸升高；第3 d開始所有濃度處理幼蟲的累積死亡率均顯著高于對照（P＜0.05，下同）；處理后第7 d，菌株QL1發(fā)酵液濃度1.5×105～1.5×109CFU/mL處理下幼蟲的累積死亡率分別為60.00%、66.67%、73.33%、75.00%和81.67%（表1）。

表1 菌株QL1不同濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Table 1 Cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae treated with strain QL1 fermentation broth of different concentrations

運(yùn)用DPS進(jìn)行生物測定，結(jié)果顯示，以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株QL1發(fā)酵液處理馬鈴薯葉片，馬鈴薯塊莖蛾取食7 d后的LT50在3.03～5.73 d，濃度最高時LT50最短，表明濃度越高對3齡幼蟲的殺蟲活性越強(qiáng)，毒力方程相關(guān)系數(shù)在0.982～0.992，毒力方程擬合程度較好（表2）。各濃度菌株QL1發(fā)酵液處理葉片后，馬鈴薯塊莖蛾取食第3、5和7 d的LC50分別為7.99×108、3.21×106和2.73×103CFU/mL，表明菌株QL1對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的致死作用表現(xiàn)出明顯的劑量與效應(yīng)關(guān)系，隨時間延長LC50逐漸降低（表3）。

表2 菌株QL1不同濃度發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力（7 d）Table 2 Virulence of different concentrations of strain QL1 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae（7 d）

表3 不同處理時間菌株QL1發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力Table 3 Virulence of different treatment times of strain QL1 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae

從圖4可看出，處理1 d后，菌株QL1發(fā)酵液處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于發(fā)酵上清液和菌懸液處理，而發(fā)酵上清液和菌懸液處理間無顯著差異（P＞0.05，下同）；從處理第4 d起，3種處理對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對照；在第7 d時，菌株發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液處理對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率分別達(dá)81.67%、50.00%和60.00%。

圖4 取食菌株QL1不同溶液后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Fig.4 Daily cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae after feeding different solutions of strain QL1

2.2.3 菌株YH2發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力 以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株YH2發(fā)酵液處理馬鈴薯葉片，馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲取食后的累積死亡率均隨著處理時間延長而逐漸升高，第3 d開始所有濃度處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對照；處理后第7 d，菌株YH2發(fā)酵液濃度1.5×105～1.5×109CFU/mL處理造成該幼蟲的累積死亡率分別為48.33%、53.33%、55.00%、61.67%和65.00%，除最低濃度發(fā)酵液處理外，其他濃度處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率間無顯著差異（表4）。

表4 菌株YH2不同濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Table 4 Cumulative mortality rate of P. operculella 3rd instars larvae treated by different concentrations of strain YH2 fermentation broth

運(yùn)用DPS進(jìn)行生物測定，由數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)制分析可知，以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株YH2發(fā)酵液處理馬鈴葉片，馬鈴薯塊莖蛾取食7 d后LT50在5.58～7.07 d，濃度最高時LT50最短，但不同濃度處理間LT50差距不明顯，毒力方程相關(guān)系數(shù)在0.965～0.991，毒力方程擬合程度較好；1.5×105CFU/mL的發(fā)酵液處理因致死率低于50.00%，故無法估算LT50（表5）。此外，菌株YH2菌體無顯著致死效應(yīng)，因此無法以菌體濃度來估算其對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的LC50。

表5 菌株YH2不同濃度發(fā)酵液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力（7 d）Table 5 The toxicity of different concentrations of strain YH2 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae（7 d）

從圖5可看出，在處理第7 d時，菌株YH2發(fā)酵液和發(fā)酵上清液處理對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率間無顯著差異，且均顯著高于菌懸液和對照處理；從第3 d后，發(fā)酵液處理的累積死亡率一直為3種處理中最高，且3種處理對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對照處理；在第7 d時，菌株YH2發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液處理對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率分別達(dá)65.00%、55.00%和38.33%。

圖5 取食菌株YH2不同溶液后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Fig.5 Daily cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae after being fed with different solutions of strain YH2

2.2.4 菌株QL1和YH2不同溶液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力差異 比較供試菌株QL1和YH2不同溶液處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲7 d后的毒力差異，結(jié)果（表6）顯示，菌株YH2發(fā)酵液處理后幼蟲的累積死亡率顯著低于菌株QL1發(fā)酵液處理；菌株QL1和YH2發(fā)酵上清液處理后其幼蟲的累積死亡率間無顯著差異；菌株YH2菌懸液處理后幼蟲的累積死亡率顯著低于菌株QL1菌懸液處理，且累積死亡率低于50.00%，無法估算其LT50。

表6 菌株QL1與YH2不同溶液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲累積死亡率的影響Table 6 Effects of different solutions of strains QL1 and YH2 on cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae

3 討論

本研究從云南主栽馬鈴薯品種麗薯6號和會-2葉片中分別分離到對馬鈴薯塊莖蛾有殺蟲活性的內(nèi)生細(xì)菌芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌QL1和紅球菌屬的帶化紅球菌YH2。當(dāng)前對馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，在文獻(xiàn)報道的馬鈴薯塊莖內(nèi)生細(xì)菌研究中發(fā)現(xiàn)了與本研究供試菌株相同菌屬的細(xì)菌（戴超，2017；Liu et al.，2020），但未發(fā)現(xiàn)同一個種的內(nèi)生細(xì)菌，表明在不同馬鈴薯植株部位和品種，不同馬鈴薯種植地區(qū)和生長環(huán)境等條件下可能存在同菌屬的內(nèi)生細(xì)菌，但因這些條件不同也使各馬鈴薯品種存在其獨有的內(nèi)生細(xì)菌種類。此外，在研究報道分離的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌中，其功能主要有促進(jìn)和抑制馬鈴薯生長、使植株致病或抑制病原菌的作用（Pageni et al.，2014；Istifadah et al.，2018；陳星伊等，2020），尚未發(fā)現(xiàn)對馬鈴薯塊莖蛾有殺蟲活性的內(nèi)生細(xì)菌。

本研究通過室內(nèi)生物測定發(fā)現(xiàn)，在1.5×109CFU/mL濃度下，菌株QL1和YH2發(fā)酵液處理7 d后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率可達(dá)81.67%和65.00%，表明2種供試菌株對該幼蟲有較強(qiáng)的致死率。研究表明，菌株QL1和YH2對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒殺作用有明顯差異的同時也存在相似之處：2種菌株的不同溶液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均有殺蟲活性，且均表現(xiàn)為發(fā)酵液殺蟲活性更強(qiáng)，菌懸液及發(fā)酵上清液單獨使用對幼蟲的毒殺效果較發(fā)酵液低，該結(jié)果與粘質(zhì)沙雷氏菌對馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性特點相似（蘇造堂等，2020），這可能是菌體在液體培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)生了具有殺蟲活性的次生代謝產(chǎn)物被充分溶解，幼蟲取食后導(dǎo)致死亡率升高，但其具體原因還有待深入研究驗證。此外，在處理第7 d時，菌株QL1菌懸液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒殺效果高于發(fā)酵上清液處理，而菌株YH2則相反，其原因可能與幼蟲取食2種菌株后對其腸道微生物產(chǎn)生的影響有關(guān)，因為昆蟲腸道菌群的變化可對宿主的生長代謝造成直接影響，甚至可導(dǎo)致疾病等（魏博帆等，2021）

蘇云金芽孢桿菌是一種傳統(tǒng)的殺蟲細(xì)菌，已開發(fā)為害蟲生防產(chǎn)品用于多種農(nóng)林害蟲和衛(wèi)生害蟲的生物防治，此類細(xì)菌也被應(yīng)用于防治馬鈴薯塊莖蛾（杜霞等，2021），可在馬鈴薯收獲前施用以抵御馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在田間對塊莖的侵害，已成為印度、秘魯和埃及等國家防治馬鈴薯塊莖蛾的重要藥劑（Aryal and Jung，2015）。本研究從馬鈴薯葉片中分離獲得的蘇云金芽孢桿菌QL1，其不同溶液對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均具有較強(qiáng)的殺蟲活性。紅球菌屬的細(xì)菌種類豐富、分布廣泛、代謝功能多樣，具有的酶種類豐富，可降解許多合成或天然的有機(jī)化合物（吳金芳等，2022），但鮮有對防治蟲害方面的研究報道。帶化紅球菌作為植物內(nèi)生菌時可釋放多種細(xì)胞分裂素對寄主植物形態(tài)造成顯著影響，還可引起寄主植物一系列的疾病癥狀（Jameson，2019）。而本研究分離到的帶化紅球菌YH2發(fā)酵液和發(fā)酵上清液飼喂馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲后，其致死率均可達(dá)50.00%以上。

4 結(jié)論

從云南2種馬鈴薯主栽品種麗薯6號和會-2葉片中分別分離到內(nèi)生細(xì)菌菌株QL1和YH2，2種菌株配制的3種溶液（發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液）對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均有較強(qiáng)的殺蟲活性，可作為馬鈴薯塊莖蛾生防制劑開發(fā)的潛力菌株。