基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的雜交鯽與野生鯽群體遺傳特征研究

楊聰慧，黃雪雪，戴承華，許效瑋，王 石，劉慶峰，張 純，周 毅，劉少軍

（省部共建淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

0 引言

【研究意義】鯽（Carassius auratus）是我國(guó)淡水水域中最常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)之一，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位。野生鯽生長(zhǎng)速度極其緩慢，長(zhǎng)至一斤需要5～10年，故鯽魚(yú)養(yǎng)殖主要依賴人工培育的優(yōu)良品種，包括由優(yōu)良地方品系選育的彭澤鯽和方正銀鯽，以及利用雜交等手段培育的湘云鯽和異育銀鯽等（顏金鵬等，2007；丁立云等，2017；劉慶峰，2018）。隨著鯽魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，其品種也逐漸推陳出新。合方鯽是以日本白鯽（C.cuvieri）為母本、紅鯽（C.cuvierired var.）為父本，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)培育獲得的新型優(yōu)質(zhì)品種，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，已在全國(guó)多地推廣養(yǎng)殖（王靜等，2015；劉慶峰，2018；Liu et al.，2018，2019a，2019b）。新型同源二倍體類(lèi)鯽（New homodiploid crucian carp-like species，NCRC）品系來(lái)源于鯉（Cyprinus carpioL.，♀）×團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala，♂）的雜交組合，具有無(wú)口須、側(cè)線鱗、鰭條數(shù)目、體色等外形特征，與鯽非常相似（Wang et al.，2017，2021；焦妮，2019）。NCRC品系頭部較小、體背較高，在育種實(shí)踐中具有良好應(yīng)用潛力，可作為魚(yú)類(lèi)物種進(jìn)化研究的基礎(chǔ)材料。因此，對(duì)合方鯽、NCRC等新型優(yōu)良鯽及其養(yǎng)殖周邊地區(qū)的野生鯽群體進(jìn)行遺傳特征研究，有助于為魚(yú)類(lèi)遺傳育種開(kāi)拓新的種質(zhì)資源，同時(shí)為魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)前的研究認(rèn)為鯽屬包括3個(gè)種，分別是分布在歐洲和我國(guó)額爾齊斯河流域的黑鯽（C.carassius）、分布在日本的白鯽（C.auratus cuvieri），以及廣泛分布于歐亞大陸和東方各島嶼的鯽復(fù)合種（C.auratuscomplex）。鯽復(fù)合種因地理分布廣、表型變異大，又被分成不同亞種，包括我國(guó)的普通鯽魚(yú)（C.auratus auratus）和銀鯽（C.auratus gibelio），日本的關(guān)東鯽（C.auratus langsdorfii），以及其他地方種群，如彭澤鯽、普安鯽、高背鯽等（董傳舉等，2020）。鯽屬物種分類(lèi)極其復(fù)雜，不同種群形態(tài)相似，因此通常需要借助分子標(biāo)記來(lái)研究物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及群體遺傳分化等問(wèn)題。線粒體基因組具有遵循母系遺傳、進(jìn)化速率快、重組率較低等特點(diǎn)（劉東東等，2022），其編碼區(qū)的COI、COII和Cytb基因及非編碼區(qū)的D-loop序列等均為最常用的DNA分子標(biāo)記。Komiyama等（2009）、Wang等（2013）基于多個(gè)線粒體基因片段的分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果表明，金魚(yú)與自然水域中的野生鯽為同一物種，且最早可能馴化于長(zhǎng)江下游的安徽、浙江等地，與歷史文獻(xiàn)記載一致。至今，基于線粒體基因組的鯽屬物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及群體遺傳分化研究已有較多報(bào)道。Murakami等（2001）利用線粒體D-loop區(qū)對(duì)多個(gè)鯽群體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，建議將白鯽從亞種地位提升到獨(dú)立的物種；Takada等（2010）基于多個(gè)線粒體基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析，將鯽復(fù)合種劃分為日本支系和歐亞大陸支系；Gao等（2012）基于線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因?qū)a屬物種的譜系地理結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，驗(yàn)證了日本種群與我國(guó)大陸種群的遺傳分化，并建議將歐亞大陸的鯽復(fù)合種劃分為6個(gè)地理種群；程磊等（2012）利用線粒體COI基因驗(yàn)證了DNA條形碼物種鑒定方法在鯽屬物種劃分中的可行性。鯽屬群體中四倍體與六倍體同時(shí)存在，甚至發(fā)現(xiàn)少量八倍體，其多倍體的起源問(wèn)題一直是鯽屬物種的研究熱點(diǎn)之一（董傳舉等，2020）。已有多個(gè)研究利用線粒體基因和核基因片段分析四倍體鯽和六倍體鯽的群體遺傳分化情況，結(jié)果證實(shí)六倍體鯽群體來(lái)自同域四倍體鯽群體的多次獨(dú)立多倍化起源（Luo et al.，2014；Liu et al.，2017a，2017b）。【本研究切入點(diǎn)】在魚(yú)類(lèi)遺傳育種領(lǐng)域，隨著野生資源的減少，人工培育和改良的優(yōu)質(zhì)魚(yú)類(lèi)品系逐漸成為魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源的重要組成。合方鯽和NCRC作為新型優(yōu)良雜交鯽魚(yú)品系，其研究主要集中在經(jīng)濟(jì)性狀或遺傳物質(zhì)變異方面（王靜等，2015；Wang et al.，2017，2021；Liu et al.，2019a，2019b），而針對(duì)群體遺傳的相關(guān)研究較少，因此亟待開(kāi)展雜交鯽飼養(yǎng)群體的群體遺傳特征及遺傳分化研究，為其品系的延續(xù)和品種改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以合方鯽、NCRC、實(shí)驗(yàn)紅鯽及湖南省的地方野生鯽群體為研究對(duì)象，對(duì)其線粒體COI基因片段和D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，解析各群體的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)和群體歷史動(dòng)態(tài)等，旨在揭示雜交鯽群體與野生鯽群體的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為開(kāi)展鯽育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試鯽魚(yú)樣本包括2個(gè)雜交品系、1個(gè)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖品系和3個(gè)野生群體。雜交品系為湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的合方鯽（HFJ，30尾）和NCRC（27尾）；實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖品系為南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部吳瑞生教授課題組培育的實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系（RCC，16尾）；野生鯽樣本于2018年9月—2019年1月分別采自湖南省長(zhǎng)沙市望城區(qū)（WC，14尾）、湖南省長(zhǎng)沙市長(zhǎng)沙縣（CSX，30尾）和湖南省常德市（CD，25尾）。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

每個(gè)樣本取尾鰭組織置于-20 ℃冰箱保存，使用基因組提取試劑盒Tissue DNA Kit（OMEGA）提取基因組DNA。擴(kuò)增線粒體COI基因片段的引物為COI-F（5'-ACCCACCGCCTAAACACTCG-3'）和COI-R（5'-ACTTCTGGGTGACCAAAGAATCA-3'）（程磊等，2012），擴(kuò)增線粒體D-loop區(qū)的引物為CR-F（5'-TTAAAGCATCGGTCTTGTAA-3'）和CR-R（5'-G CCCTGAAATAGGAACCAGA-3'）（Liu et al.，2017b）。PCR反應(yīng)體系30.0 μL：DNA模板3.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，2×RapidTaqMaster Mix 15.0 μL，TE Buffer 9.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，55 ℃（擴(kuò)增COI基因片段）或50 ℃（擴(kuò)增D-loop區(qū)）退火30 s，72 ℃50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SeqMan 7.1對(duì)測(cè)序得到的DNA序列峰圖進(jìn)行人工校對(duì)和拼接，并以MUSCLE進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。分別基于COI基因、D-loop區(qū)及二者聯(lián)合序列，使用DnaSP 6.12進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，包括單倍型多樣性（Haplotype diversity，h）和核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）；基于COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)，結(jié)合錯(cuò)配分布分析（Mismatch distribution analysis）評(píng)估群體歷史動(dòng)態(tài)；基于COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列，通過(guò)MEGA 7.0.26計(jì)算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離，運(yùn)用PopART中的TCS Network繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)（Haplotype network），再以Structure 2.3.4推測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu)；利用Arlequin 3.5.2.2計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)（Population differentiation，F(xiàn)ST），并進(jìn)行分子變異方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）。

同時(shí)基于COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的單倍型數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，在GenBank下載鯉（KF856965.1）為外群，以及黑鯽（JQ911695.1）、日本白鯽（AP011237.1）和關(guān)東鯽（NC002079.1）共同分析；使用MEGA 7.0.26 基于Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter，K2P）構(gòu)建鄰接法（Neighborjoining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，其置信度采用Bootstrap為1000次進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)；經(jīng)jModelTest 2.1.10評(píng)估后，以HKY+I+G為進(jìn)化模型，分別通過(guò)最大似然法（Maximum likelihood，ML）和貝葉斯推斷法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。其中，ML分析使用IQtree 1.6.12，其分支置信度評(píng)估Bootstrap 設(shè) 為1000 次 重 復(fù)；BI 分 析 采 用MrBayes 3.2.7，馬爾科夫鏈蒙特卡洛（Markov chain Monte Crlo，MCMC）模擬運(yùn)行1×106代，1000代取樣1次，通過(guò)后驗(yàn)概率評(píng)估分支置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征及遺傳多樣性分析結(jié)果

對(duì)合方鯽品系（HFJ，30個(gè)樣本）、NCRC品系（27個(gè)樣本）、實(shí)驗(yàn)紅鯽品系（RCC，16個(gè)樣本）、望城野生鯽（WC，14個(gè)樣本）、長(zhǎng)沙野生鯽（CSX，30個(gè)樣本）和常德野生鯽（CD，25個(gè)樣本）共6個(gè)群體的線粒體COI基因片段和D-loop區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得長(zhǎng)度為687和427 bp的目的序列各142條。在線粒體COI基因序列中，檢測(cè)到保守位點(diǎn)643個(gè)（占93.6%），變異位點(diǎn)44個(gè)（占6.4%）；堿基組成為A占26.2%、T占28.5%、G占16.7%和C占28.6%，A+T為54.7%；共鑒定出14個(gè)單倍型，各群體的h介于0.214～0.780，π介 于0.00035～0.00218（表1）。在 線 粒 體D-loop區(qū)中，檢測(cè)到保守位點(diǎn)385個(gè)（占90.2%），變異位點(diǎn)42個(gè)（占9.8%）；堿基組成為A占36.5%、T占30.3%、G占13.7%和C占19.5%，A+T為66.8%，具有明顯的A/T偏好；共鑒定出21個(gè)單倍型，各群體的h介于0.214～0.863，π介于0.00165～0.01039（表1）。此外，與COI基因序列相比，D-loop區(qū)雖然較短，但其遺傳變異更大，符合線粒體基因組非編碼區(qū)的特征。

將COI基因與D-loop區(qū)進(jìn)行聯(lián)合，其總序列長(zhǎng)度為1114 bp，共鑒定出25個(gè)單倍型，對(duì)應(yīng)的h為0.907，π為0.02373（表1）。其中，3個(gè)野生鯽群體均具有較高的h和π，最高的是常德野生鯽群體（h=0.877，π=0.00532）；2個(gè)雜交鯽品系及實(shí)驗(yàn)紅鯽品系的h和π相對(duì)較低，h最低的群體為NCRC品系（h=0.214），π最低的群體為合方鯽品系（π=0.00086）?？梢?jiàn)，線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列可提供更多的遺傳信息，因此本研究的系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)等分析均使用聯(lián)合序列進(jìn)行計(jì)算。

表1 基于線粒體COI基因、D-loop區(qū)及聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體遺傳多樣性分析結(jié)果Table 1 Genetic diversity analysis based on mitochondrial COI gene，D-loop region and their joint sequences

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列，從6個(gè)鯽群體中共鑒定出25個(gè)單倍型（Hap1～Hap25）。其中，單倍型Hap4在3個(gè)野生鯽群體中均有分布，單倍型Hap18為NCRC品系和常德野生鯽群體共享，單倍型Hap20為NCRC品系和實(shí)驗(yàn)紅鯽品系共享，剩余22個(gè)單倍型為各群體的特有單倍型。通過(guò)TCS Network繪制的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1）可知，3個(gè)野生鯽群體及實(shí)驗(yàn)紅鯽品系的單倍型交錯(cuò)在一起，且相距較近，表明這些群體間無(wú)明顯的譜系分化。合方鯽品系和NCRC品系的單倍型均與其他群體相距較遠(yuǎn)，且形成相對(duì)獨(dú)立的聚群。

圖1 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Haplotype network structure chart based on joint sequences of mitochondrial COI gene and D-loop region

為進(jìn)一步解釋單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分別通過(guò)NJ、ML和BI等3種方法對(duì)6個(gè)鯽群體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，3種方法獲得的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，因此僅展示BI系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2），并在節(jié)點(diǎn)位置標(biāo)注每種方法的置信度。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）可看出，3個(gè)野生鯽群體和實(shí)驗(yàn)紅鯽品系的大部分單倍型緊密聚集為一支，但各群體尚未形成單系群；NCRC品系聚在該分支外部，也未形成單系群；合方鯽品系與日本白鯽聚在一起，以較高的置信度（BI=1，ML=96/99，NJ=100）單獨(dú)形成一個(gè)分支，與黑鯽、鯉共同組成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的基部。

圖2 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 BI phylogenetic tree based on joint sequences of mitochondrial COI gene and D-loop region

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)特征

基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列，對(duì)6個(gè)鯽群體進(jìn)行遺傳距離和群體間遺傳分化分析，結(jié)果如表2所示。6個(gè)鯽群體的群體內(nèi)平均遺傳距離為0.0027，遺傳距離最小的是合方鯽品系（0.0009），最大的是常德野生鯽群體（0.0054）；群體間的平均遺傳距離為0.0253，其中，望城野生鯽群體與長(zhǎng)沙野生鯽群體間的遺傳距離最?。?.0038），合方鯽品系與其他5個(gè)鯽群體間的遺傳距離均較大，為0.0539～0.0628。6個(gè)鯽群體兩兩間均可檢測(cè)到遺傳分化，其FST介于0.05417～0.98331；長(zhǎng)沙野生鯽群體與常德野生鯽群體間的FST最小，為0.05417，達(dá)顯著水平（P＜0.05，下同）；合方鯽品系與其他5個(gè)鯽群體間的FST較大（0.95147～0.98331），且均達(dá)極顯著水平（P＜0.01，下同）。

表2 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體遺傳分化和遺傳距離分析結(jié)果Table 2 Genetic differentiation and genetic distances analysis of the 6 curcian carp populations based on joint sequences of mitochondrial COI gene and D-loop region

基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列，對(duì)6個(gè)鯽群體進(jìn)行Structure聚類(lèi)分析，推測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu)。設(shè)群體分組數(shù)目K為1～6，各種分組重復(fù)運(yùn)算10次，基于ΔK的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，較合適的分組方式如圖3望城野生鯽WC長(zhǎng)沙野生鯽CSX常德野生鯽CD實(shí)驗(yàn)紅鯽RCC合方鯽HFJ新型同源二倍體類(lèi)鯽NCRC所示。當(dāng)6個(gè)鯽群體分為2組時(shí)（K=2），合方鯽品系獨(dú)自為一組，其他5個(gè)鯽群體聚為一組；分為3組時(shí)（K=3），合方鯽品系和NCRC品系各自為一組，其余4個(gè)鯽群體聚為一組；分為4組時(shí)（K=4），合方鯽品系、NCRC品系和實(shí)驗(yàn)紅鯽品系各自為一組，而3個(gè)野生鯽群體聚為一組。

圖3 基于線粒體COI 基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.3 Genetic structure based on joint sequences of mitochondrial COI gene and D-loop region of the 6 crucian carp populations

基于Structure聚類(lèi)分析結(jié)果的3種分組方式，對(duì)6個(gè)鯽群體進(jìn)行AMOVA分析，進(jìn)一步探究其群體結(jié)構(gòu)，以揭示群體的遺傳變異來(lái)源。結(jié)果（表3）顯示，在K=2、K=3、K=4不同分組方式下，均顯示遺傳變異主要來(lái)自于組間（約90.00%），但組間遺傳分化系數(shù)（FCT）不具顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)群體間和群體內(nèi)的遺傳變異相對(duì)較小（低于10.00%），但組內(nèi)的群體間遺傳分化系數(shù)（FSC）和FST均達(dá)極顯著水平。此外，組間變異占比隨分組增多而升高，當(dāng)K=4時(shí)擁有最大組間變異（90.14%），說(shuō)明2個(gè)雜交品系及實(shí)驗(yàn)紅鯽品系與3個(gè)野生鯽群體間已出現(xiàn)一定的遺傳分化。

表3 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體AMOVA分析結(jié)果Table 3 AMOVA analysis of joint sequences of mitochondrial COI gene and D-loop region of the 6 crucian carp populations

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果

基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)合序列，利用Tajima’sD和Fu’sFs模型對(duì)6個(gè)鯽群體的群體歷史動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果（表4）顯示，NCRC品系的Tajima’sD檢驗(yàn)為顯著性負(fù)值，表明其可能經(jīng)歷過(guò)群體擴(kuò)張事件，或受到選擇壓力及瓶頸效應(yīng)的作用；其他群體的Tajima’sD和Fu’sFs檢驗(yàn)結(jié)果均為非顯著性偏離零值，符合中性進(jìn)化的假設(shè)。但核苷酸錯(cuò)配分布分析結(jié)果（圖4）顯示，6個(gè)鯽群體的核苷酸錯(cuò)配分布曲線均呈現(xiàn)多峰，表明各群體在近期歷史上并未經(jīng)歷過(guò)明顯的群體擴(kuò)張。

圖4 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體核苷酸錯(cuò)配分布檢驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Nucleotide mismatch distribution analysis based on mitochondrial COI gene and D-loop region of the 6 crucian carp populations

表4 基于線粒體COI基因和D-loop區(qū)聯(lián)合序列的6個(gè)鯽群體中性檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 4 Neutrality test analysis based on mitochondrial COI gene and D-loop region of the 6 crucian carp populations

3 討論

遺傳多樣性分析是研究和保護(hù)生物多樣性的重要環(huán)節(jié)。本研究對(duì)6個(gè)鯽群體的線粒體COI基因和D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，并進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，鯽線粒體COI基因和D-loop區(qū)序列均具有明顯的A/T偏好，符合硬骨魚(yú)線粒體基因組的序列特征。根據(jù)Grant和Bowen（1998）提出的群體多樣性判斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)論是線粒體COI基因、D-loop區(qū)序列還是二者聯(lián)合序列的分析結(jié)果均顯示3個(gè)野生鯽群體為高單倍型多樣性（h＞0.500），而合方鯽品系、NCRC品系和實(shí)驗(yàn)紅鯽品系為低單倍型多樣性（h＜0.500）；6個(gè)鯽群體的線粒體COI基因均為低核苷酸多樣性（π＜0.005），而D-loop區(qū)序列表現(xiàn)為長(zhǎng)沙野生鯽群體和常德野生鯽群體為高核苷酸多樣性（π＞0.005），二者聯(lián)合序列顯示常德野生鯽群體為高核苷酸多樣性。D-loop處于線粒體非編碼區(qū)，受到的選擇壓力較小，在大部分鯽樣本中線粒體D-loop區(qū)的遺傳變異程度明顯高于線粒體COI基因，因此二者聯(lián)合分析更能反應(yīng)群體遺傳多樣性的變化情況。鄧朝陽(yáng)（2015）基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列比較了彭澤鯽、方正銀鯽、異育銀鯽3個(gè)養(yǎng)殖品系和野生鯽群體間的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性明顯低于野生鯽群體。類(lèi)似研究結(jié)果在翹嘴鱖（成為為等，2020）、草魚(yú)（歐陽(yáng)美等，2021）、巖原鯉（岳華梅等，2021）、黃姑魚(yú)（趙祥等，2021）和小黃魚(yú)（郭丹丹等，2022）等魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖群體中也得到證實(shí)，說(shuō)明經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)在人工繁殖過(guò)程中普遍存在多態(tài)性降低的現(xiàn)象，因此需要警惕養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)種質(zhì)衰退等問(wèn)題。

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，對(duì)6個(gè)鯽群體間的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行推測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)野生鯽群體并未按照采樣地進(jìn)行聚類(lèi)，說(shuō)明各地域野生鯽群體間的差異不顯著，與劉科均（2020）收集分析湖南省內(nèi)包括“湘資沅澧”流域及洞庭湖水域共41個(gè)地點(diǎn)鯽樣本的結(jié)論一致，即各群體的形態(tài)差異和遺傳分化未達(dá)亞種水平，尚未形成較穩(wěn)定的地方群體。此外，雖然實(shí)驗(yàn)紅鯽品系與野生鯽群體間不存在共享單倍型，但緊密聚集在一起，未能形成獨(dú)立一支，可能與本研究選用的分子標(biāo)記較少有關(guān)。王余德等（2021）利用線粒體4個(gè)基因片段（COI、COII、Cytb基因和D-loop區(qū)）的聯(lián)合序列實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)紅鯽品系的有效鑒別。NCRC品系雖然與實(shí)驗(yàn)紅鯽品系和野生鯽群體間存在共享單倍型，但相距較遠(yuǎn)。Wang等（2020）對(duì)NCRC（F1～F3）全線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其線粒體DNA與母本（鯉）差異較大，而與鯽更相似。Gu等（2022）利用線粒體基因和核基因標(biāo)記研究NCRC的起源，結(jié)果顯示其與鯽復(fù)合體間存在非常親密的種內(nèi)關(guān)系。綜合本研究結(jié)果，推測(cè)NCRC確屬于鯽復(fù)合體的一種，但與野生鯽也有一定的遺傳差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上合方鯽品系的單倍型獨(dú)自聚在一起，并與日本白鯽聚為一支，表明其線粒體來(lái)源于母本（日本白鯽），與劉慶峰（2018）的研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究再次驗(yàn)證了白鯽物種的獨(dú)立性，均符合此前研究中鯽屬的物種劃分標(biāo)準(zhǔn)（Murakami et al.，2001；劉良國(guó)等，2010；Takada et al.，2010；程磊等，2012；Gao et al.，2012）。

在DNA條形碼技術(shù)中，通常將1%～2%的種間遺傳距離作為物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)（Hebert et al.，2003a，2003b）。本研究進(jìn)一步利用遺傳距離和群體間的FST來(lái)檢測(cè)各鯽群體的遺傳分化水平，結(jié)果顯示，6個(gè)鯽群體的群體內(nèi)遺傳距離均小于1%，說(shuō)明各群體內(nèi)部的遺傳變異較小。兩兩群體間的遺傳距離分析也發(fā)現(xiàn)，3個(gè)野生鯽群體和實(shí)驗(yàn)紅鯽品系間的遺傳距離均小于1%，遺傳差異不明顯；NCRC品系與這4個(gè)鯽群體間的遺傳距離處于1%～2%，出現(xiàn)一定的遺傳差異；合方鯽品系與其他5個(gè)群體間的遺傳距離均大于2%，高達(dá)5%～7%，遺傳差異較大。根據(jù)Wright（1965）提出基于FST判斷群體間遺傳分化程度的標(biāo)準(zhǔn)，本研究中3個(gè)野生鯽群體間的遺傳分化較?。?.05＜FST＜0.15），而實(shí)驗(yàn)紅鯽品系、合方鯽品系及NCRC品系與除各自群體外的其他5個(gè)鯽群體均已產(chǎn)生高度遺傳分化（FST＞0.25）?？梢?jiàn)，3個(gè)野生鯽群體間遺傳差異較小，遺傳分化不明顯；實(shí)驗(yàn)紅鯽品系與野生鯽群體間的遺傳差異雖然較小，但已產(chǎn)生明顯的遺傳分化；NCRC品系與其他鯽品系的遺傳差異較大，遺傳分化明顯；合方鯽品系與其他鯽群體的遺傳差異和遺傳分化均最明顯。本研究的AMOVA分析結(jié)果展示了3種較理想的分組情況（K=2、K=3和K=4），且發(fā)現(xiàn)隨著分組數(shù)目的增加，組間遺傳變異百分比也逐漸增加，在分組結(jié)果中依次將合方鯽品系、NCRC品系、實(shí)驗(yàn)紅鯽品系與野生鯽群體分離開(kāi)，進(jìn)一步佐證了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化和遺傳分化分析的結(jié)果。合方鯽品系的遺傳分化是因其母本白鯽與鯽復(fù)合種不屬于同一物種所導(dǎo)致（劉慶峰，2018）；實(shí)驗(yàn)紅鯽品系的遺傳分化可能與養(yǎng)殖過(guò)程中的瓶頸效應(yīng)、遺傳漂變等因素有關(guān)；而NCRC品系的遺傳分化除了受瓶頸效應(yīng)、遺傳漂變等因素影響外，可能還與其雜交起源及復(fù)雜的遺傳背景相關(guān)聯(lián)（Wang et al.，2020）；野生群體間并未產(chǎn)生明顯的遺傳分化可能與各地水域開(kāi)放交互導(dǎo)致的鯽群體繁育自由、基因流頻繁等因素有關(guān)（劉科均，2020）。

從群體歷史動(dòng)態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在Tajima’sD檢驗(yàn)中僅有NCRC品系為顯著性負(fù)值，表明其可能發(fā)生過(guò)規(guī)模擴(kuò)張或定向選擇；但在Fu'sFs檢驗(yàn)中6個(gè)鯽群體的結(jié)果均不顯著，核苷酸錯(cuò)配分布曲線也呈現(xiàn)多峰，考慮到NCRC品系的Tajima’sD檢驗(yàn)結(jié)果并未達(dá)極顯著水平，故推測(cè)6個(gè)鯽群體在近期歷史上保持相對(duì)穩(wěn)定，未曾經(jīng)歷過(guò)明顯的群體擴(kuò)張。

4 結(jié)論

合方鯽品系、NCRC品系及實(shí)驗(yàn)紅鯽品系3個(gè)養(yǎng)殖群體與3個(gè)野生鯽群體間已產(chǎn)生明顯的遺傳分化，且存在一定程度的遺傳多樣性降低等問(wèn)題。因此，在后續(xù)的鯽育種工作中應(yīng)適當(dāng)擴(kuò)大繁育親本數(shù)量，避免近親繁殖和瓶頸效應(yīng)，注重保護(hù)養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源的遺傳多樣性。