CRISPR/Cas9系統(tǒng)在傳染病診療中的應(yīng)用進(jìn)展①

高 哲 張榮榮 賈天軍

（河北北方學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，病原生物學(xué)與免疫研究所，張家口 075000）

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clustered regu?larly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/CRISPR 相 關(guān) 蛋 白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系統(tǒng)是一種源自古細(xì)菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的快速發(fā)展使基因工程領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化。作為基因編輯的工具，CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對(duì)于鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）更加簡(jiǎn)單，并具有獨(dú)特的切割機(jī)制，可靶向多個(gè)區(qū)域，因此被廣泛采用，成為大多數(shù)基因編輯的首選工具。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以作為一種新的治療方法用于某些疾病的預(yù)防和治療，如慢性肝炎、寄生蟲(chóng)感染和人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）感染。本文著重對(duì)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在傳染病診療中的最新應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

84%的古細(xì)菌和45%的細(xì)菌中均存在CRISPR/Cas 單元，這是一種抵御外來(lái)噬菌體和外源DNA 的免疫機(jī)制［1］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因組序列由CRIS?PR 基因座、Cas 基因和tracrRNA 構(gòu)成。CRISPR 基因座包括前導(dǎo)序列（leader）、間隔序列（spacers）和重復(fù)序列（repeats）［2］。前導(dǎo)序列位于重復(fù)序列的上游，含有CRISPR 系統(tǒng)的啟動(dòng)子；間隔序列是一段回文結(jié)構(gòu)，位于重復(fù)序列之間，可識(shí)別外源DNA；重復(fù)序列是一段高度保守序列，其序列的5'端為GTTTG，3'端為GAAAC［3］。Cas 基因位于CRISPR 基因座側(cè)旁，編碼對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行特異性切割的Cas蛋白。tracrRNA 具有與CRISPR 短重復(fù)序列互補(bǔ)的區(qū)域，起連接crRNA 和Cas 蛋白的作用，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)成熟并發(fā)揮作用的關(guān)鍵［4］。

目前應(yīng)用最廣，研究最深的是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)比其他類(lèi)型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)更加簡(jiǎn)單，標(biāo)志蛋白為Cas9 蛋白［5］。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用機(jī)制大致可分為3個(gè)階段：①新間隔序列的獲?。和ㄟ^(guò)對(duì)入侵的外源DNA 進(jìn)行掃描，Cas9識(shí)別潛在的原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM），以確定原型間隔序列。然后對(duì)外源DNA 進(jìn)行切割，產(chǎn)生新的間隔序列，儲(chǔ)存到CRISPR/Cas 系統(tǒng)中［6］；②CRISPR 基因座的表達(dá)：首先CRISPR 基因座轉(zhuǎn)錄為前體crRNA（pre-crRNA）和tracrRNA。precrRNA 被加工為成熟的crRNA 后和tracrRNA 形成引導(dǎo)序列sgRNA，將指導(dǎo)Cas9 靶向并切割入侵的DNA［4］；③防御階段：sgRNA 與Cas9 結(jié)合，識(shí)別靶DNA PAM 位點(diǎn)，并在目標(biāo)位點(diǎn)引入雙鏈斷裂（DSB）［7］。DSB 可通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）的方式進(jìn)行修復(fù)，并通過(guò)這2 種方式實(shí)現(xiàn)特定基因的插入、校正、破壞和缺失。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是迄今為止最簡(jiǎn)單、有效和多功能的系統(tǒng)，只需設(shè)計(jì)sgRNA 即可在任何DNA 靶點(diǎn)生成DSB。對(duì)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用機(jī)制的研究，為其體外應(yīng)用提供了理論依據(jù)。因此，這種編輯技術(shù)已在科學(xué)界迅速普及。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在病毒感染中的應(yīng)用

2.1 在HIV 治療中的應(yīng)用 通過(guò)CRISPR/Cas9 對(duì)真核細(xì)胞有效的基因編輯，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這種方法可用于治療人類(lèi)病毒感染。研究表明，CRISPR/Cas9 基因編輯是治療HIV 感染的一種新方法。EBINA 等［8］設(shè)計(jì)了一種針對(duì)HIV 基因組中長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并在人類(lèi)T細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞系Jurkat 細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)證明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以在LTR 區(qū)域切割病毒基因組，誘導(dǎo)突變，甚至具有從宿主細(xì)胞基因組中消除內(nèi)部整合HIV 基因的能力。由此表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以治療HIV 潛伏感染。LIAO 等［9］將Cas9 和gRNA 整合到人多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）基因組中，生成CRISPR/Cas9-hPSCs。將CRISPR/Cas9-hPSCs 分化為相對(duì)均一的細(xì)胞群，用HIV 感染這些細(xì)胞，研究人員發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞對(duì)HIV 有明顯的抵抗力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有治療HIV感染新策略的潛力。

然而，由于HIV 可逃避CRISPR/Cas9 的編輯，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療HIV 仍有限制性。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)靶向共同受體也可抑制HIV 感染，其中CCR5 是 最 重 要 的 一 種 受 體。XIAO 等［10］使 用CRISPR/Cas9 和2 個(gè)sgRNA 共同編輯CCR5，并通過(guò)NHEJ 途徑阻斷CCR5 的表達(dá)，增強(qiáng)了CD4+T 細(xì)胞對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的抵抗力，為抗HIV-1/AIDS的潛在基因治療方法提供新的途徑。PSIP1 基因編碼的LEDGF/p75 是整合酶的輔助因子，是HIV 基因整合到宿主細(xì)胞染色體所必須的。LAMPI 等［11］使用CRISPR/Cas9對(duì)PSIP1位點(diǎn)進(jìn)行頂點(diǎn)編輯，將第366位的天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺（D366N），中斷了LEDGF/p75 與HIV 整合酶的相互作用，但不會(huì)影響LEDGF/p75 在細(xì)胞內(nèi)的功能。研究人員發(fā)現(xiàn)，D336N 細(xì)胞中HIV 復(fù)制減弱，表明靶向LEDGF/p75有助于HIV的治療。

miRNAs 在各種疾病中的功能是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。miR146 是一種與HIV 感染相關(guān)的mi-RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可減少CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，并降低抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生和活化的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用［12］。TENG 等［13］通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除miR-146a，破壞miR-146a 細(xì)胞因子通路，增加細(xì)胞因子和干擾素刺激基因的表達(dá)，從而加強(qiáng)對(duì)HIV 感染的抗病毒反應(yīng)。因此，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向miRNAs 有助于HIV 的治療。最近研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)激活內(nèi)源性的抗病毒化合物Tetherin 基因，增加其表達(dá)可抑制HIV 復(fù)制［14］。另一方面，科學(xué)家目前已經(jīng)可以使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)體外編輯人的B 細(xì)胞，使其表達(dá)抗HIV-1 廣譜中和抗體，并保留其參與體液免疫的能力，用于HIV的治療［15］?？傊?，CRISPR/Cas9 是治療HIV 的新方法，但目前仍存在一定的局限性，需要進(jìn)一步的研究。

2.2 在肝炎治療中的應(yīng)用 肝炎病毒感染是引起肝炎的主要原因，其中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是最危險(xiǎn)且最常見(jiàn)的。HBV是一種DNA病毒，通過(guò)與鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合入侵肝細(xì)胞［16］。HBV基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，由松弛的環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），并整合到肝細(xì)胞基因組中。機(jī)體HBV 免疫應(yīng)答是造成肝損傷的主要原因，特別是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）可清除HBV 感染的肝細(xì)胞，直接造成肝損傷［17］。如果治療不及時(shí)，慢性乙型肝炎可轉(zhuǎn)化為肝硬化。目前臨床治療HBV 感染的方法主要是逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）抑制劑和基于IFN-α的免疫調(diào)節(jié)劑。然而，這些藥物均存在一個(gè)缺點(diǎn)，那就是它們不能根除cccDNA，停藥后HBV 復(fù)制反彈。目前，研究人員正在探尋效果更好、更徹底的方法，其中通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)治療HBV 感染取得了一定的進(jìn)展。

CRISPR/Cas9治療HBV感染的主要趨向是降低肝內(nèi)HBV cccDNA 表達(dá)，從而抑制HBV 的慢性感染。RAMANAN 等［18］使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向和切割HBV 基因組保守區(qū)域，顯著降低HBV cccDNA 表達(dá)水平，證明了Cas9 進(jìn)行cccDNA 定向抗病毒治療的潛力。最近，KOSTYUSHEV 等［19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CRISPR/Cas9 可導(dǎo)致cccDNA 降解和移碼突變，從而顯著降低cccDNA 產(chǎn)生病毒RNA 的能力。與腦膜炎奈瑟菌（neisseria meningitidis，Nm）和弗朗西斯氏菌（francisella novicida，F(xiàn)n）相比，來(lái)自化膿鏈球菌（streptococcus pyogenes，Sp）和嗜熱鏈球菌（strepto?coccus thermophilus，St）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效靶向HBV cccDNA 降解和抑制HBV 復(fù)制，在轉(zhuǎn)染后6 d 內(nèi)導(dǎo)致90%以上的HBV cccDNA 降解，抗HBV活性更高，并且更加安全。然而Sp CRISPR/Cas9 與腺相關(guān)病毒（adenovirus associated，AAV）載體不兼容，存在運(yùn)輸困難的問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，研究人員在金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，Sa）中鑒定出更小的Cas9蛋白，以AAV為載體運(yùn)輸。并且研究發(fā)現(xiàn)，Sa CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以準(zhǔn)確有效地靶向HBV 基因組并抑制HBV 的復(fù)制，可以作為治療慢性HBV 感染的一種新策略［20］。另一方面，WANG 等［21］構(gòu) 建 了 一 種HBV 特 異 性gRNA-miRHBV-gRNA 三元盒以探究miR-31 對(duì)CRISPR/Cas9在消除HBV cccDNA 中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-31 與2 種HBV 特 異 性gRNA 在 抑 制HBV 復(fù) 制方面具有協(xié)同作用，可增強(qiáng)CRISPR/Cas9 清除HBV cccDNA 和抑制HBV 復(fù)制的能力。對(duì)于修復(fù)通路在CRISPR/Cas9抗HBV活性中作用的研究在近期也取得了一定進(jìn)展。KOSTYUSHEV 等［22］使用NHEJ 的強(qiáng)抑制劑NU7026，發(fā)現(xiàn)抑制NHEJ 會(huì)削弱CRISPR/Cas9 對(duì)HBV cccDNA 的降解，從而說(shuō)明了NHEJ 對(duì)于CRISPR/Cas9 抗HBV 的重要性，并且也進(jìn)一步證明了CRISPR/Cas9 對(duì)于降解cccDNA 的高效性。以上實(shí)驗(yàn)均表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)有望用于臨床治療人體HBV感染。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的DNA靶向性已經(jīng)被廣泛研究。然而，HCV 是一種RNA 病毒，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向RNA 的潛在治療作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。研究人員在Fn 中鑒定出一種既能靶向DNA 又能靶向RNA 的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。該CRISPR/Cas 基因座中包含1 個(gè)獨(dú)特的小RNA，稱(chēng)為CRISPR/Cas 相關(guān)小RNA（scaRNA）［23］。scaRNA 的功能與crRNA 幾乎相同：它與tracrRNA 相互作用，與Fn Cas9 形成靶向復(fù)合物。PRICE 等［24］開(kāi)發(fā)了針對(duì)HCV 基因組的RNA靶向引導(dǎo)RNA（rgRNA）。rgRNA 具有與sgRNA 相似的設(shè)計(jì)，包含與單鏈scaRNA 結(jié)合的tracrRNA 序列。通過(guò)產(chǎn)生與HCV 基因組互補(bǔ)的scaRNAs 序列，F(xiàn)n Cas9 可以與HCV RNA 特異性地相互作用。并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明Fn Cas9系統(tǒng)可以靶向并抑制HCV 基因的復(fù)制和表達(dá)，證明了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)治療HCV感染的可行性。近年來(lái)，研究者在此方面進(jìn)行了大量的研究。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding ，lncRNAs）在許多細(xì)胞生理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。其中l(wèi)ncRNA-IFI6 是1 種新的lncRNA，獨(dú)立于JAK-STAT途徑調(diào)節(jié)HCV 感染，可負(fù)調(diào)控干擾素誘導(dǎo)蛋白6（interferon-induced protein 6，ITIF6）啟動(dòng)子，從而增加HCV 復(fù) 制。LIU 等［25］研究表明CRISPR/Cas9 對(duì)lncRNA-IFI6 基因的突變誘導(dǎo)和破壞可抑制HCV 感染。另一方面，DUAN 等［26］使用CRISPR/Cas9-gRNA或siRNA 過(guò)度表達(dá)或敲除miR-130a 和其靶基因自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5），發(fā)現(xiàn)ATG5顯著上調(diào)HCV復(fù)制并下調(diào)ISGs表達(dá)。由此證明了miR-130a 通過(guò)ATG5 依賴(lài)性自噬途徑靶向ATG5以調(diào)節(jié)宿主抗病毒反應(yīng)和HCV 復(fù)制。雖然目前對(duì)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)治療HCV 感染的研究取得一定進(jìn)展，但就目前的研究成果來(lái)看，將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于臨床治療上仍需要很長(zhǎng)的一段時(shí)間。

2.3 在新型冠狀病毒研究中的應(yīng)用 冠狀病毒是引起人類(lèi)呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)病因。2019 年世界爆發(fā)了由未知病毒引起的肺炎疫情，通過(guò)對(duì)患者分泌物的檢測(cè)確定這是1種先前未知的冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將其命名為“COVID-19”。準(zhǔn)確、快速的診斷工具對(duì)于控制疫情至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)在COVID-19 肺炎診斷中有很大潛力，尤其是CRISPR/Cas13系統(tǒng)具有很好的診斷效果［27］。由于目前缺少抗病毒藥物和疫苗，因此迫切需要?jiǎng)游锬Ｐ?。SUN 等［28］利用CRISPR/Cas9 敲入技術(shù)建立了一個(gè)表達(dá)人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（human angiotensin converting enzyme，hACE2）的小鼠模型，探究嚴(yán)重急性呼吸道綜合征2 型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的傳播和發(fā)病機(jī)制。小鼠模型中hACE2 的組織分布與COVID-19 患者的臨床發(fā)現(xiàn)相吻合，在肺中檢測(cè)到高水平的hACE2 表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)老年hACE2 小鼠的病理變化更接近COVID-19 患者。因此，該模型有望成為評(píng)價(jià)COVID-19 疫苗和治療方法的工具。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在寄生蟲(chóng)感染中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)不但可以治療病毒感染，在治療寄生蟲(chóng)感染方面也具有潛在的療效。在克氏錐蟲(chóng)線粒體鈣離子攝入蛋白1（MICU1）和MICU2 對(duì)其致病性影響的研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除這2 個(gè)基因，觀察到敲除MICU1 和MICU2 的克氏錐蟲(chóng)的生長(zhǎng)速度減緩并且侵襲能力降低［29］。其結(jié)果揭示了這2種基因似乎在克氏錐蟲(chóng)致病性中起著關(guān)鍵作用，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行靶向治療，有望成為治療錐蟲(chóng)病的新途徑。

惡性瘧原蟲(chóng)是一種引起瘧疾的寄生蟲(chóng)。惡性瘧原蟲(chóng)的線粒體核糖體對(duì)維持線粒體膜電位和寄生蟲(chóng)生存能力至關(guān)重要。LING 等［30］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了PfmtRPS12 和PfmtRPS18 基因，發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲(chóng)出現(xiàn)生長(zhǎng)衰竭，從而表明對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)線粒體核糖體的破壞抑制了線粒體的代謝能力，使寄生蟲(chóng)對(duì)靶向線粒體功能的抑制劑過(guò)敏。惡性瘧原蟲(chóng)線粒體電子傳遞鏈中的一些蛋白質(zhì)是由線粒體中的線粒體核糖體翻譯的。在另一項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)了能夠靶向編碼惡性瘧原蟲(chóng)線粒體核糖體蛋白L13（RPL13）基因的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明CRISPR/Cas9 敲除PfmRPL13 可導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)線粒體膜電位喪失、生長(zhǎng)停滯和死亡［31］。此外，研究表明，利用CRISPR/Cas9阻斷惡性瘧原蟲(chóng)中棒狀體蛋白R(shí)ON3 基因的表達(dá)，可降低紅細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，并損害瘧原蟲(chóng)的生命周期［32］。

研究人員還探討了CRISPR/Cas9治療弓形蟲(chóng)病的療效。在最近的研究中，MA 等［33］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除弓形蟲(chóng)wx2 基因，結(jié)果表明wx2 基因的缺失明顯抑制了宿主細(xì)胞體外寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)和復(fù)制，降低了小鼠體內(nèi)寄生蟲(chóng)的毒力。在另一項(xiàng)研究中，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除弓形蟲(chóng)免疫作圖蛋白1（toxoplasma gondii immune mapping protein 1，TgIMP1）基因，結(jié)果顯示基因敲除株的增殖明顯降低，毒力減弱［34］?？傊?，CRISPR/Cas9 可能是一種更有效治療寄生蟲(chóng)感染的新方法，但其在寄生蟲(chóng)體內(nèi)運(yùn)輸困難仍是目前需要解決的問(wèn)題之一，希望未來(lái)能找到解決這一問(wèn)題的有效方法，使其更好的應(yīng)用于臨床治療。

4 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas9 技術(shù)具有高度的DNA 特異性、較高的選擇性和較低的副產(chǎn)物水平，其快速發(fā)展推動(dòng)了基因編輯應(yīng)用的迅速擴(kuò)展，并對(duì)藥物和生物技術(shù)研究產(chǎn)生了重大影響。目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)在治療各種細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)感染性疾病方面的應(yīng)用受到廣泛討論。這項(xiàng)技術(shù)可以用來(lái)破壞病毒和寄生蟲(chóng)等傳染源的基因組，或者破壞與病毒和非病毒感染的發(fā)病機(jī)制有關(guān)的宿主細(xì)胞基因，從而治療感染。而且通過(guò)與其他技術(shù)相結(jié)合，CRISPR/Cas9還可用于疫苗的研制。

然而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)目前仍存在缺陷。其中，最關(guān)鍵的缺陷是其潛在的脫靶效應(yīng)。研究人員目前已開(kāi)發(fā)出許多方法來(lái)減少脫靶效應(yīng)，如偏靶或無(wú)偏靶檢測(cè)、堿基編輯、gRNA 修飾和抗CRISPR（Acr）蛋白等［35］。但在臨床廣泛應(yīng)用該技術(shù)治療疾病之前，還需要提高其效率、特異性和實(shí)用性。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在臨床治療方面有著巨大的潛力，未來(lái)必將改變治療疾病的方式，為人類(lèi)健康保駕護(hù)航。