人血清PCT直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立及性能評(píng)價(jià)①

楊進(jìn)波 焦 蓉 孫 莉 曹 琳 武軍駐 童 偉

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，襄陽(yáng) 441000）

降鈣素原（procalcitonin，PCT）是降鈣素前體，分子量約為13 kD，由甲狀腺C 細(xì)胞分泌形成，包含降鈣蛋白、降鈣素與N 殘基片段［1］。研究表明，PCT 在診斷膿毒癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征與急性呼吸窘迫綜合征等疾病時(shí)具有較高的敏感性與特異性［2］。PCT作為一項(xiàng)重要炎癥指標(biāo)，在疾病輔助診斷治療、指導(dǎo)抗生素使用方面具有重要價(jià)值［3］。PCT 的半衰期一般為25～30 h，相比IL-6、TNF-α 等半衰期只有數(shù)分鐘至幾小時(shí)的炎癥因子，PCT穩(wěn)定性更好；對(duì)比傳統(tǒng)驗(yàn)證指標(biāo)C-反應(yīng)蛋白（CRP），患者血漿PCT 濃度在升高2 h 后就可用分析儀檢測(cè)，而CRP 在炎癥過(guò)程開(kāi)始8～12 h后才能檢測(cè)出來(lái)［4-5］。

PCT 作為炎癥指標(biāo)在醫(yī)院各大科室應(yīng)用廣泛，目前許多醫(yī)院檢測(cè)PCT 以熒光免疫層析法為主，該方法勝在設(shè)備體積小巧，且定量靈敏度遠(yuǎn)高于同類膠體產(chǎn)品，特別適合科室及小型醫(yī)院使用［6］?；瘜W(xué)發(fā)光法雖在靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性等方面性能優(yōu)異，但其設(shè)備往往非常龐大，對(duì)于科室與小型醫(yī)院并不友好［7］。國(guó)產(chǎn)化學(xué)發(fā)光分析儀器的發(fā)展迅速，應(yīng)市場(chǎng)需求，近幾年衍生出面向科室的中小型化學(xué)發(fā)光儀器，如國(guó)賽公司Kemilo POCT 化學(xué)發(fā)光分析儀、萬(wàn)孚公司POC 全自動(dòng)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光儀以及科斯邁公司SMART 500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀等。這些儀器兼具體積小與化學(xué)發(fā)光平臺(tái)性能出眾的特點(diǎn)，其中科斯邁SMART 500 儀器為全開(kāi)放式系統(tǒng)，可直接設(shè)置各類參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，本研究選擇該設(shè)備作為研究設(shè)備，根據(jù)PCT 雙抗體夾心法原理成功建立人血清PCT 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，對(duì)該方法各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并與目前醫(yī)院正在穩(wěn)定使用的熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)性比對(duì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本 158 份不包含抗凝劑的空腹血采集自襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，常溫靜置20～40 min，待血液完全凝固后以3 000 r/min 離心20 min，收集上清液即為血清，保存至-20 ℃以下待用。所有標(biāo)本采集于2020年11月至12月。

1.1.2 主要試劑與儀器 配對(duì)PCT 捕獲抗體與檢測(cè)抗體均購(gòu)自金斯瑞公司（Ab-1：克隆號(hào)16A1、IgG1亞類；Ab-2：克隆號(hào)12C5、IgG2b 亞類；Ab-3：克隆號(hào)E72、IgG1 亞類）；重組PCT 抗原購(gòu)自啟泰生物（來(lái)源：E.coli；分子量16.1 kD）；吖啶酯、牛血清白蛋白（BSA）、ProClin 300 購(gòu)自Sigma 公司；鏈霉親和素磁珠購(gòu)自重慶博藍(lán)鷹生物技術(shù)有限公司；降鈣素原檢測(cè)試劑盒（干式免疫熒光法）購(gòu)自基蛋公司，醫(yī)療器械注冊(cè)證編號(hào)：蘇械注準(zhǔn)20162401534，批號(hào)：P018210025，4～30 ℃密封保存，有效期為18 個(gè)月。SMART 500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)自科斯邁公司（渝械注準(zhǔn)20192220077）；Getein1600全自動(dòng)熒光免疫定量分析儀購(gòu)自基蛋公司（蘇械注準(zhǔn)20142220013）；BY-L600型離心機(jī)購(gòu)自白洋醫(yī)療器械公司；凍干機(jī)購(gòu)自四環(huán)儀器；移液器購(gòu)自大龍公司。

1.2 方法

1.2.1 磁微粒試劑的制備 采用含1%BSA 的0.01 mol/L 的Tris 緩沖液（pH=7.4）將鏈霉親和素磁珠稀釋到0.4 mg/ml，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 吖啶酯標(biāo)記PCT 檢測(cè)抗體 PBS（pH=7.4）透析置換抗體緩沖體系，調(diào)整抗體濃度為1 mg/ml。吖啶酯用無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺配制成3 mg/ml溶液。取500μl抗體溶液，加入一定量的吖啶酯溶液，室溫避光振蕩反應(yīng)40 min，G25 脫鹽純化柱純化，加入等體積甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生物素化PCT抗體制備 PBS（pH=7.4）透析置換抗體緩沖體系，調(diào)整PCT 抗體濃度為1 mg/ml。N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯用無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺配制成5 mg/ml 溶液。將N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶液按照一定投料摩爾比加入PCT 抗體溶液中，室溫反應(yīng)30～60 min，結(jié)束后加入賴氨酸終止反應(yīng)20 min，脫鹽柱除去體系中多余生物素結(jié)合物，加入等體積甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCT 校準(zhǔn)品制備 PCT 無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，本研究將PCT 校準(zhǔn)品定值溯源至行業(yè)公認(rèn)測(cè)量程序（即基蛋公司PCT 免疫熒光檢測(cè)系統(tǒng)），具體配制與溯源過(guò)程如下：準(zhǔn)確量取一定量的PCT 抗原，溶于含0.5%BSA 的PBS 緩沖液，制成PCT 校準(zhǔn)品濃縮液，Getein1600 全自動(dòng)熒光免疫定量分析儀校準(zhǔn)后標(biāo)定PCT校準(zhǔn)品濃縮液濃度，向含0.5%BSA的PBS緩沖液中分別加入不同量的PCT 校準(zhǔn)品濃縮液，制成濃度分別為0、0.5、1.6、7.0、30.0、100.0 ng/ml 的PCT校準(zhǔn)品溶液，使用儀器對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，除零校準(zhǔn)點(diǎn)外，其他濃度點(diǎn)偏差應(yīng)在10%范圍內(nèi)。每個(gè)濃度點(diǎn)各分裝1 ml 于凍存管中，凍干48 h 制備成凍干粉校準(zhǔn)品，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 檢測(cè)程序設(shè)定 SMART 500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀設(shè)定檢測(cè)程序，反應(yīng)杯中加入20μl樣本、生物素化PCT 抗體、吖啶酯標(biāo)記的PCT 抗體，37 ℃恒溫孵育15 min 形成生物素-PCT 捕獲抗體-抗原-PCT 檢測(cè)抗體-吖啶酯復(fù)合物，加入磁微粒試劑，孵育5 min。磁場(chǎng)吸引復(fù)合物，清洗液洗滌，加入100 μl 預(yù)激發(fā)液、100 μl 激發(fā)液。免疫復(fù)合物中吖啶酯在2 種試劑作用下形成激發(fā)態(tài)中間體，激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)出恒定波長(zhǎng)可見(jiàn)光，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀傳感器可檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。發(fā)光強(qiáng)度與血清PCT濃度在一定線性范圍內(nèi)成正比，四參數(shù)Logistic方程擬合后即可計(jì)算血清樣本中PCT的濃度。

1.2.6 配對(duì)抗體篩選 3 株P(guān)CT 抗體（Ab-1、Ab-2、Ab-3）分別用生物素、吖啶酯標(biāo)記，兩兩交叉配對(duì)實(shí)驗(yàn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估每對(duì)抗體的標(biāo)曲相關(guān)系數(shù)r；選取PCT 陽(yáng)性樣本、陰性樣本各1份，用初步建立的方法測(cè)定陽(yáng)性樣本與陰性樣本的儀器發(fā)光值比值（P/N），見(jiàn)表1。

表1 配對(duì)抗體篩選Tab.1 Matched antibody pairs screening

1.2.7 生物素化PCT 捕獲抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤(pán)實(shí)驗(yàn)法。生物素與PCT 捕獲抗體進(jìn)行偶聯(lián)，分別按照7.5∶1、15∶1、30∶1 的摩爾比偶聯(lián)（因素A）。每個(gè)生物素偶聯(lián)物的工作濃度分別按照1∶50、1∶100、1∶200 的比例稀釋（因素B），采用雙因素交叉實(shí)驗(yàn)評(píng)估校準(zhǔn)品擬合的線性及信噪比（S1/S0），見(jiàn)表2。

表2 生物素化PCT捕獲抗體濃度及稀釋比例選擇Tab.2 Selection of biotinylated PCT capture antibody concentration and dilution ratio

1.2.8 吖啶酯標(biāo)記PCT 檢測(cè)抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤(pán)實(shí)驗(yàn)法。吖啶酯與PCT 檢測(cè)抗體標(biāo)記，分別按照5∶1、10∶1、20∶1的摩爾比標(biāo)記（因素A）。每個(gè)濃度的標(biāo)記物工作濃度分別按照1∶250、1∶500、1∶1 000 稀釋（因素B）。雙因素交叉實(shí)驗(yàn)評(píng)估校準(zhǔn)品擬合的線性和信噪比（S1/S0），見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)記物濃度及稀釋比例的選擇Tab.3 Selection of marker concentration and dilution ratio

1.2.9 反應(yīng)時(shí)間選擇 確定生物素偶聯(lián)PCT 捕獲抗體、吖啶酯標(biāo)記PCT 檢測(cè)抗體工作濃度，進(jìn)一步探究最佳的反應(yīng)時(shí)間。設(shè)定反應(yīng)時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min、20 min，評(píng)估不同時(shí)間下校準(zhǔn)品的回歸曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間校準(zhǔn)品相對(duì)發(fā)光值Fig.1 Relative luminescence value of calibrator under different reaction times

1.2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 將已標(biāo)定濃度的PCT 抗原母液稀釋至100 ng/ml，濃度記為Xs；取低值血清樣本與參考品（抗原母液配制）以9∶1 的體積比混合，分別檢測(cè)低值血清樣本與混合樣本，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3 次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值（X0 與X）。根據(jù)公式P=（10X-9X0）/Xs×100%計(jì)算出回收率P。

1.2.11 線性試驗(yàn) 接近線性范圍上限的高濃度（活性）樣品和接近線性范圍下限的低濃度（活性）樣品混合成至少5 個(gè)稀釋濃度（xi）（包括下限、中限及 上 限）。即 配 制 濃 度 為0.02、20.01、40.01、60.01、80.00、100.00 ng/ml 的線性參考品，每個(gè)稀釋濃度測(cè)試3 次，分別求出測(cè)定結(jié)果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）對(duì)數(shù)為自變量，測(cè)定結(jié)果均值（yi）對(duì)數(shù)為因變量擬合線性。

1.2.12 空白限試驗(yàn) 用零濃度校準(zhǔn)品S0 作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20 次，得出20 次測(cè)量結(jié)果的相對(duì)發(fā)光值，計(jì)算xˉ和s，將xˉ±2s代入校準(zhǔn)品曲線公式，即得本方法空白限。

1.2.13 精密度試驗(yàn) 配制濃度分別為0.5 ng/ml和10 ng/ml 的樣品，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)10 次，計(jì)算批內(nèi)精密度；重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，以30 次檢測(cè)結(jié)果計(jì)算批間精密度。

1.2.14 特異性試驗(yàn) 配制濃度為30 ng/ml 的人鈣抑肽（human katacalcin），10 ng/ml的人降鈣素（human calcitonin），10 000 ng/ml 的人α-降鈣素基因相關(guān)肽（human α-CGRP），10 000 ng/ml 的人β-降鈣素基因相關(guān)肽（human β-CGRP）進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.15 與干式免疫法試劑盒的比較試驗(yàn) PCT定量檢測(cè)試劑與基蛋生物干式免疫法試劑盒分別檢測(cè)158份臨床血清樣本，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2019 分析，樣本濃度由化學(xué)發(fā)光免疫分析儀通過(guò)四參數(shù)Logistic方程擬合得到，線性回歸采用最小二乘法進(jìn)行直線擬合。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)的建立

2.1.1 配對(duì)抗體篩選 結(jié)果顯示，Ab-1 作為捕獲抗體，Ab-3 作為檢測(cè)抗體進(jìn)行配對(duì)，所獲得的相關(guān)系數(shù)r和P/N值結(jié)果最好。

2.1.2 生物素化PCT 捕獲抗體濃度及工作濃度篩選 隨PCT 捕獲抗體濃度升高，線性相關(guān)系數(shù)呈升高趨勢(shì)。隨生物素濃度升高，信噪比降低。因此根據(jù)PCT 校準(zhǔn)曲線線性與信噪比情況，篩選出最優(yōu)的偶聯(lián)條件為：生物素與PCT捕獲抗體摩爾比為15∶1，生物素偶聯(lián)物工作濃度為1∶100，在該條件下線性和信噪比最優(yōu)，且原料用量較少。

2.1.3 吖啶酯標(biāo)記PCT 檢測(cè)抗體濃度及工作濃度篩選 吖啶酯標(biāo)記PCT 偶聯(lián)物稀釋至1∶500 時(shí)信噪比降低，標(biāo)記物的線性和信噪比達(dá)到最優(yōu)。因此，篩選出的最優(yōu)偶聯(lián)條件為：吖啶酯與PCT 檢測(cè)抗體摩爾比為10∶1。吖啶酯標(biāo)記的PCT 偶聯(lián)物的稀釋比例為1∶500 時(shí)，校準(zhǔn)曲線擬合的線性相關(guān)系數(shù)和信噪比最好，且原料用量較少。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間選擇 隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，校準(zhǔn)品各個(gè)濃度點(diǎn)的相對(duì)發(fā)光值也隨之升高，一定時(shí)間后基本達(dá)到平衡，為實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)，反應(yīng)時(shí)間選擇15 min。

2.2 試劑性能評(píng)價(jià)

2.2.1 準(zhǔn)確度 本方法回收率為95.65%，處于85%～115%范圍內(nèi)，滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的準(zhǔn)確度要求，見(jiàn)表4。

表4 準(zhǔn)確度（ng/ml）Tab.4 Accuracy（ng/ml）

2.2.2 線性 PCT 線性回歸方程為y=0.981x+0.658 9，R2=0.999 1，各檢測(cè)結(jié)果在（0.02～100）ng/ml范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r＞0.99，表明線性范圍符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，見(jiàn)圖2。

圖2 線性范圍評(píng)估Fig.2 Linear range evaluation

2.2.3 空白限 空白限檢測(cè)結(jié)果表明該試劑盒空白限為0.01 ng/ml。

2.2.4 精密度 批內(nèi)、批間精密度結(jié)果見(jiàn)表5、表6，本檢測(cè)方法批內(nèi)精密度分別為5.35%、5.06%（＜8%），批間精密度分別為5.69%、5.44%（＜10%），精密度均優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表5 批內(nèi)精密度（n=10，ng/ml）Tab.5 Intra-run precision（n=10，ng/ml）

表6 批間精密度（n=30，ng/ml）Tab.6 Inter-assay precision（n=30，ng/ml）

2.2.5 特異性 測(cè)定30 ng/ml 人鈣抑肽、10 ng/ml人降鈣素、10 000 ng/ml 人α-CGRP、10 000 ng/ml 人β-CGRP對(duì)PCT測(cè)定結(jié)果的影響，測(cè)值均＜0.05 ng/ml，見(jiàn)表7。說(shuō)明血清中這幾種特異性物質(zhì)對(duì)PCT 檢測(cè)不發(fā)生交叉反應(yīng)。

表7 特異性檢測(cè)結(jié)果（ng/ml）Tab.7 Specific test results（ng/ml）

2.2.6 與干式免疫法試劑盒比較 二者相關(guān)性方程為y=1.050 1x+0.228 5，R2=0.948 7，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明本方法與基蛋生物的干式免疫法檢測(cè)系統(tǒng)相關(guān)性較好。

圖3 兩種試劑盒樣本測(cè)定結(jié)果相關(guān)性Fig.3 Correlation of test results of two kits

3 討論

PCT 通常由甲狀腺的濾泡旁細(xì)胞（C 細(xì)胞）及腸、肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生［8］。PCT 前體經(jīng)內(nèi)源多肽酶的酶切作用形成小分子，能以游離形式存在于血清中，發(fā)揮生物學(xué)功能［9］。許多臨床研究結(jié)果表明，機(jī)體受細(xì)菌性感染后，引起全身炎癥反應(yīng)時(shí)，血清PCT 水平顯著升高［10-13］。研究發(fā)現(xiàn)，臨床上PCT的監(jiān)測(cè)對(duì)嚴(yán)重細(xì)菌感染與膿毒癥早期診斷更為適用，可更快速地反映治療效果。感染性疾病早期診斷中PCT 檢測(cè)較WBC 計(jì)數(shù)、C-CRP 白檢測(cè)及影像學(xué)檢查具有更好的特異性［14］。PCT作為一種炎癥標(biāo)志物，是診斷感染性疾病的重要依據(jù)之一，同時(shí)對(duì)非感染性疾病也具有一定的指導(dǎo)意義，研究表明機(jī)體受到病毒性感染時(shí)，可產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放特定細(xì)胞因子（如IFN-γ），可降低PCT 表達(dá)。由于這一選擇性細(xì)胞機(jī)制，PCT 在辨別細(xì)菌性感染與病毒性感染中有重要臨床意義［15］。此外，PCT 亦可指導(dǎo)臨床經(jīng)驗(yàn)性的抗生素使用，避免濫用抗生素，同時(shí)對(duì)疾病的發(fā)展過(guò)程及轉(zhuǎn)歸進(jìn)行預(yù)估。在腎移植排斥反應(yīng)及感染中，PCT也有重要的診斷意義［16］。

許多研究者對(duì)現(xiàn)有國(guó)產(chǎn)化PCT 診斷試劑與進(jìn)口試劑做過(guò)比對(duì)研究。楊琴等［17］比較了安圖生物公司PCT 試劑盒與羅氏公司試劑盒，結(jié)果表明二者整體對(duì)比相關(guān)性良好，在一定程度上可滿足醫(yī)院PCT臨床檢測(cè)需求。李結(jié)周［18］對(duì)新產(chǎn)業(yè)公司化學(xué)發(fā)光試劑盒與瑞萊公司熒光免疫試劑盒進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，瑞萊公司熒光免疫法在便攜性方面勝過(guò)化學(xué)發(fā)光法，但準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性等性能方面不及新產(chǎn)業(yè)化學(xué)發(fā)光法。從比對(duì)研究中不難看出，目前市場(chǎng)上PCT 試劑盒的更新迭代主要在于試劑盒的國(guó)產(chǎn)化、國(guó)產(chǎn)替代進(jìn)口，優(yōu)化國(guó)產(chǎn)試劑性能達(dá)到進(jìn)口試劑的水準(zhǔn)；以及檢測(cè)方法更新、以性能更優(yōu)異的化學(xué)發(fā)光免疫分析法替代酶聯(lián)免疫、熒光免疫、放射免疫等方法。

基蛋公司檢測(cè)儀器及PCT 試劑是通過(guò)國(guó)家相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的檢測(cè)體系，測(cè)試結(jié)果整體穩(wěn)定可靠，試劑盒質(zhì)量過(guò)關(guān)，故本研究選取該試劑盒比對(duì)，結(jié)果顯示該方法與基蛋生物干式免疫法檢測(cè)臨床樣本結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R2=0.948 7），說(shuō)明該方法與醫(yī)院原有檢測(cè)平臺(tái)差異性小。該方法空白限為0.01 ng/ml，回收率為95.65%，線性范圍為0.02～100.00 ng/ml、批內(nèi)精密度均值為5.21%，批間精密度均值為5.57%，與人鈣抑肽、α-CGRP、β-CGRP 基因相關(guān)肽無(wú)交叉反應(yīng)，各項(xiàng)性能檢測(cè)符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

綜上所述，本研究建立的PCT 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法兼具小巧、高性能兩方面優(yōu)點(diǎn)，且原料主要為國(guó)產(chǎn)，儀器為開(kāi)放式國(guó)產(chǎn)小型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備，在國(guó)家不斷推動(dòng)體外診斷試劑國(guó)產(chǎn)化的大背景下，該方法可供各大試劑廠家借鑒參考。