華東沿海地區(qū)多中心40例胰腺腫瘤患者基因組圖譜分析

王 晶， 譚 斌， 趙志杰， 仲灝辰， 曲林林

青島大學附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 山東 青島 266003

胰腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，且預后差，由于其隱匿性，許多中晚期患者失去了手術機會。近年來，靶向藥物和免疫檢查點抑制劑在多種實體腫瘤中得到了有效應用，但在胰腺癌的治療中卻難以取得突破性進展，5年生存率不足9%[1]。隨著基因檢測技術和下一代測序技術在臨床上的廣泛應用，越來越多的腫瘤針對特定的驅動基因進行靶向治療，一些罕見的基因突變可用于指導臨床作出個體化治療決策。為了解我國沿海地區(qū)胰腺癌基因突變圖譜，本研究對胰腺癌患者進行了腫瘤相關基因全序列、突變基因序列和潛在藥物靶點序列的比對。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年6月青島大學附屬醫(yī)院、青島市立醫(yī)院、煙臺山醫(yī)院、煙臺中法友好醫(yī)院收治的胰腺惡性腫瘤患者，并進行隨訪。納入標準：經(jīng)病理診斷為胰腺惡性腫瘤。排除標準：(1)未行手術治療的患者；(2)臨床資料缺失。

1.2 研究方法 采集腫瘤樣本和血液對照樣本，進行下一代測序。對納入患者的腫瘤組織樣本和血液樣本進行基因組檢測。從所有固定石蠟包埋樣本中提取至少50 ng DNA。從全血分離的血細胞中提取DNA作為對照，用于鑒定胚系突變。應用Illumina測序儀檢測腫瘤相關基因的全部編碼外顯子和在實體瘤中頻繁重排的內含子，測序結果平均覆蓋1000倍，基因組改變的評估包括單堿基替換、短插入/缺失和長插入/缺失、拷貝數(shù)變異和基因重排。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：QYFYWZLL26520，所納入患者均簽署知情同意書。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共納入40例胰腺腫瘤患者，其中男26例，女14例，中位年齡59歲(31～77歲)。40例患者中轉移組織病理標本7例，原發(fā)腫瘤病理標本33例，其中胰腺導管腺癌(PDAC)34例(85.0%)，胰腺實性假乳頭狀腫瘤(SPN)3例(7.5%)，胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤(PNET)1例(2.5%)，分型不清2例(5.0%)。Illumina測序儀共檢測出450個腫瘤相關基因的全部編碼外顯子和64個在實體瘤中頻繁重排的內含子。

2.2 全突變分析 采用下一代測序技術對40例胰腺癌患者的450個基因進行測序，并對其病理結果進行分析。隨訪40例患者的生存時間，比較不同基因突變生存時間的差異。前5位突變基因分別是KRAS(80.0%，32/40)、TP53(70.0%，28/40)、CDKN2A(32.5%，13/40)、SMAD4(17.5%，7/40)和AKT2(17.5%，7/40)；在32例胰腺癌標本中檢測到KRAS，其中單核苷酸變異30例，復制數(shù)量變異2例(附錄1)。65%(26/40)的患者至少有1個潛在的藥物靶點，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRAF、CDKN2A、CDK6、CTNNB1、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR3、FGFR4、NTRK3、PTEN、PIK3CA、VEGFA、YES1和PD-L1。

2.3 基于性別的突變分析 男性胰腺癌患者突變最高的基因為KRAS(76.92%，20/26)和TP53(69.23%，18/26)，女性胰腺癌患者突變最高的基因亦為KRAS(78.57%，11/14)和TP53(71.43%，10/14)；在靶向藥物的突變基因中，ACVR2A、AMER1、ATM、GATA3、GLI1、KMT2C、RB1、TET3、TGFBR2突變僅見于男性患者，LRP2、ROCK1、VEGFA突變僅見于女性患者(圖1)。

圖1 男女胰腺癌患者最常見的突變基因

2.4 基于年齡的突變分析 將納入患者分為5個年齡組：Ⅰ組31～40歲(10.0%，4/40)，Ⅱ組41～50歲(12.5%，5/40)，Ⅲ組51～60歲(30.0%，12/40)，Ⅳ組61～70歲(30.0%，12/40)，Ⅴ組71～80歲(17.5%，7/40)。結果顯示，第Ⅰ組中突變頻率最高的基因為TP53和KRAS，第Ⅱ組中突變頻率最高的基因為KRAS和CDKN2A，第Ⅲ組中突變頻率最高的基因為TP53和KRAS，第Ⅳ組中突變頻率最高的基因為KRAS，第Ⅴ組中突變頻率最高的基因為KRAS、TP53和FGFR1；對于TP53突變頻率，Ⅱ組與Ⅲ組(P=0.02)比較、Ⅲ組與Ⅳ組(P=0.02)比較，差異均有統(tǒng)計學意義；對于FGFR1突變頻率，Ⅲ組與Ⅴ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)(圖2)。

圖2 不同年齡組中最常見的突變基因

2.5 基于侵犯類型的突變分析 胰腺癌伴神經(jīng)侵犯20例患者中，前5位突變基因分別為KRAS(95%，19/20)、TP53(75%，15/20)、AKT2(30%，6/20)、CDKN2A(30%，6/20)和SMAD4(20%，4/20)。胰腺癌伴血管侵犯3例患者中，前2位突變基因分別為KRAS(100%，3/3)和TP53(66.67%，2/3)(圖3)。

圖3 神經(jīng)和血管侵犯中最常見的突變基因

2.6 突變基因的生存曲線分析 在34例PDAC中，KRAS的突變率最高(100%)。在本研究中，SPN和PNET不存在TP53和KRAS突變；CTNNB1是SPN和PNET所特有的，PNET可與PDAC相鑒別(附錄1)。腫瘤突變負荷(TMB)和細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)是新興的基因組生物標志物，可用于檢測腫瘤基因組中基因突變的數(shù)量[2]，故分析了與免疫治療相關的預測指標TMB和PD-L1，結果顯示，40例患者無TMB-H表達，僅有1例PD-L1表達呈40%。40例患者的中位總生存期為14.1個月(1.57～40.63個月)，生存分析結果顯示，有無KRAS、TP53、AKT2、CDKN2A、SMAD4和CTNNB1突變的患者生存時間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖4)。

注：a，KRAS基因突變生存分析；b，TP53基因突變生存分析；c，CDKN2A基因突變生存分析；d，AKT2基因突變生存分析；e，SMAD4基因突變生存分析；f，CTNNB1基因突變生存分析。圖4 胰腺癌突變基因生存分析

3 討論

目前，手術切除已成為胰腺癌潛在的治療方法，部分患者可接受根治性切除，但由于胰腺癌通常發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，因此許多患者在經(jīng)歷了根治性手術后仍有腫瘤復發(fā)。故尋找胰腺癌早期診斷的新指標，為胰腺癌的防治探索可能的治療靶點顯得尤為重要。在我國，晚期胰腺癌患者的化療很常見。在過去30年里，吉西他濱是胰腺癌治療的黃金標準，總體生存率實現(xiàn)了適度的改善。以吉西他濱為主的聯(lián)合化療已成為晚期胰腺癌的一線治療方案，并顯示出較好的臨床療效和生存率。吉西他濱聯(lián)合NAB-紫杉醇的中位生存期為8.5個月[3]。另外，三藥聯(lián)合化療FOLFIRINOX方案僅10.2個月[4]，中位生存期不足1年。先進的基因檢測技術、分子靶向藥物和免疫治療為胰腺癌的精準治療帶來了一線曙光。本研究應用下一代測序技術對40例胰腺癌患者的基因突變圖譜進行分析，探索胰腺癌可能的藥物靶點，以及我國沿海地區(qū)胰腺癌基因突變的規(guī)律；分析和比較了不同胰腺癌(PDAC、SPN和PNET)的基因突變類型。結果發(fā)現(xiàn)，PDAC患者中KRAS突變率最高，SPN和PNET患者均未發(fā)現(xiàn)TP53和KRAS基因突變；在前5位突變基因中，可能的藥物靶點是CDKN2A，其突變率為32.5%。CDKN2A功能的喪失可能導致周期蛋白依賴性激酶(CDK)2/4/6的激活。因此，CDK抑制劑可以作為CDKN2A基因突變腫瘤的治療選擇。研究[5]顯示，胰腺癌細胞株在體外實驗中對CDK抑制劑具有不同的反應；此外，該研究還對胰腺癌細胞耐藥機制和CDK4/6抑制劑與選擇性治療劑聯(lián)合使用的可能性進行了討論。胰腺癌中CDKN2A基因突變的預測和預后尚不清楚。然而，有研究[6]表明，P16伴隨著TP53和CDKN2A的丟失與淋巴浸潤和術后廣泛的轉移有關。到目前為止，尚無CDKN2A和CDK4/6突變在胰腺癌中的臨床試驗。KRAS基因位于人類12號染色體的短臂上，全長約50 kb。KRAS通常被描述為“分子開關”，其編碼蛋白通過構象變化等途徑發(fā)揮不同的功能。當功能正常時，KRAS可以正常地調節(jié)細胞的生長過程；在功能異常時，可引起細胞內信號轉導過程的紊亂，細胞過度增殖，最終導致腫瘤的發(fā)生。KRAS基因突變在膽管癌、結腸癌、直腸癌、膽囊癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中均有發(fā)現(xiàn)。已知KRAS突變存在于大多數(shù)胰腺癌中，突變率為90%～95%[7]，而本研究中KRAS基因突變率為80%，低于其他研究結果。動物實驗[8]發(fā)現(xiàn)，通過阻斷KRAS下游信號通路的MEK抑制劑，聯(lián)合吉西他濱可以抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生長。大多數(shù)胰腺癌KRAS突變可通過吉西他濱聯(lián)合NAB-紫杉醇化療方案、基因檢測技術、分子靶向藥物和免疫治療等相關治療方法來解決，但這些治療方法均未能證明對總體存活率有顯著的臨床益處[9]。

TP53基因位于人類17號染色體的短臂上，全長約15 kb，是一種典型的抑癌基因，其p53蛋白可以維持基因穩(wěn)定，防止基因突變，被稱為“基因守護者”。TP53基因可以通過參與多種生物學過程來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括激活DNA修復過程，調節(jié)細胞周期以抑制細胞增殖，以及在DNA不可逆損傷后激活細胞凋亡。在結腸癌、肝癌、膽管癌、膽囊癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均檢測到TP53基因突變，提示TP53基因突變與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關。有研究[10]顯示，胰腺癌中TP53基因突變已達到50%～75%，突變概率約為73%[11]。本研究中TP53基因突變率為70%。在KRAS基因啟動激活突變后，TP53基因突變促使KRAS誘導的癌前病變迅速發(fā)展為胰腺癌[10]。目前尚無針對胰腺癌TP53基因突變的藥物臨床試驗。本研究結果進一步證實了KRAS和TP53在胰腺癌中具有較高突變率，它們可能成為治療胰腺腫瘤的潛在靶點。研究[12-13]顯示，胰腺癌中SMAD4基因突變的概率為30%～64%，而本研究SMAD4基因突變率為17.5%，低于其他研究。SMAD4在胰腺癌中很常見，但其作用仍需研究。大量研究[14-17]表明，SMAD4基因突變與預后不良和復發(fā)有關。AKT2基因負責調控代謝、細胞增殖、存活、生長和血管生成等多種生物學過程，其作為細胞內PI3K/Akt通路的重要組成部分，通過一系列下游底物的絲氨酸和/或蘇氨酸磷酸化來介導信號級聯(lián)反應。AKT2可被血小板衍生生長因子激活，并調節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移。AKT2基因拷貝數(shù)增加可能導致蛋白過表達，抑制AKT2表達可降低胰腺癌細胞系的致瘤性[18-19]。研究[20-21]證明，AKT2與胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤的惡性特征及化療耐藥性有關。也有報道[22-23]稱，包括吉西他濱在內的基因毒性化療藥物可誘導AKT2基因的高表達，而AKT2基因的高表達可導致腫瘤細胞對放化療不敏感。在本研究中，AKT2突變患者的生存時間和根治性切除及術后化療效果并未令人滿意。CTNNB1基因編碼多功能蛋白β-catenin，構成細胞間的黏附連接(Ahers連接)。β-catenin在上皮細胞之間產(chǎn)生并相互連接，可以與APC蛋白結合，參與Wnt信號通路的調節(jié)。Wnt通路的激活在多種腫瘤中具有重要意義。腫瘤抑制基因的APC突變或β-catenin的β磷酸化位點突變可導致β-catenin在細胞內積聚并持續(xù)激活Tcf/Lef靶基因，導致Wnt信號通路的異常激活，從而導致細胞生長失控和惡性轉化[24-26]。CTNNB1突變只出現(xiàn)在SPN和PNET中，PDAC中未發(fā)現(xiàn)CTNNB1突變。本研究數(shù)據(jù)也證實了這一點，但目前尚無針對CTNNB1突變的靶向藥物。

本研究共40例胰腺腫瘤患者，其中20例伴有神經(jīng)侵犯，突變基因前5位分別為KRAS、TP53、AKT2、CDKN2A和SMAD4；3例伴有血管侵犯，前2位突變基因為KRAS和TP53。KRAS和TP53的突變可能導致腫瘤神經(jīng)侵犯和血管侵犯，但由于樣本量較少，數(shù)據(jù)還需要進一步補充。本研究結果顯示，65%的患者至少有1個潛在的藥物靶點，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRAF、CDNK2A、CDK6、CTNNB1、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR3、FGFR4、NTRK3、PTEN、PIK3CA、VEGFA、YES1和PD-L1的表達。在靶向藥物的突變基因中，BRAF、BRCA1、CDK6、EGFR、ERBB3、ERBB4和FGFR3突變僅在男性患者中發(fā)現(xiàn)，而VEGFA突變僅在女性患者中發(fā)現(xiàn)。因此，可以推測VEGFA可能是女性胰腺癌患者的一個潛在的生物標志物。在現(xiàn)有的靶點中，僅CDKN2A的突變率>30%，大多數(shù)胰腺惡性腫瘤靶點的突變率都不高。由于突變率較低，一些胰腺惡性腫瘤靶向藥物難以獲得有效驗證，這也是胰腺惡性腫瘤突破性治療困難的原因之一。免疫療法已成為抗腫瘤治療的新熱點，尤其是PD-1和PD-L1抑制劑的問世，不僅在各種實體瘤治療中取得了豐碩的成果，在胰腺癌的治療方面也取得了一定的進展。本研究中40例患者均無TMB-H表達，僅1例PD-L1表達40%。據(jù)報道[27]，胰腺癌中TMB-H(TMB≥20muts/Mb)約為0.5%，提示目前與PD-1和PD-L1抑制劑療效相關的預測指標表達并不高。有研究[28]顯示，單藥PD-1和PD-L1抑制劑對胰腺癌的治療效果較差，培溴利珠單抗聯(lián)合NAB-紫杉醇和吉西他濱治療胰腺癌的療效高于單純化療。本研究對40例患者的生存時間進行了隨訪，并對不同突變基因進行了比較，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，可能需要積累更多的病例以進一步分析。

綜上，本研究通過對我國華東沿海地區(qū)40例胰腺癌患者的全基因序列分析，發(fā)現(xiàn)所有胰腺惡性腫瘤樣本均存在基因突變，且多為多點突變和多種類型突變。同時，所有患者都有不同的突變基因和突變位點?？傮w而言，本研究數(shù)據(jù)可能有助于為我國沿海地區(qū)胰腺癌的診斷、預后和治療策略，包括靶向及免疫治療提供一定的幫助，期待未來有更多的相關研究使其在胰腺癌的診治中發(fā)揮更大的作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王晶、譚斌負責課題設計，資料分析，撰寫論文；趙志杰、仲灝辰參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；曲林林負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

附錄1見二維碼