改良柱前熒光胺衍生化-高效液相色譜法測定豬肉中11 種磺胺類藥物殘留

王曉茵，宋翠平，孫曉亮，李木子，曹旭敏，秦立得，王淑婷，隋金鈺，王玉東，趙思俊

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島 266032）

磺胺類藥物是一類以對氨基苯磺酰胺為基本母核結構的合成抗菌藥物，具有廣譜抗菌性，而且價格低廉，作為預防、治療細菌感染性疾病的藥物被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖過程中。然而，由于在畜禽養(yǎng)殖過程中存在不合理使用甚至濫用藥物的情況，極易導致其在畜禽產品中的殘留，對人類健康產生極大的威脅和危害，為此，我國規(guī)定動物組織中磺胺類藥物總最大殘留限量為100 μg/kg。

國內外學者對磺胺類藥物殘留的檢測方法開展了廣泛研究，包括液相色譜技術、液相色譜-質譜聯(lián)用技術、免疫學分析法和毛細管電泳法等，其中，液相色譜和液相色譜-質譜聯(lián)用技術以其高分辨率和高靈敏度被普遍應用。液相色譜-質譜聯(lián)用技術能夠同時分析多種物質，方法的準確性和靈敏度高，但儀器設備價格昂貴，且對操作人員要求較高。而采用高效液相色譜-紫外檢測器進行檢測時，由于大多數磺胺類藥物的最佳紫外吸收波長為270～280 nm，但是該波長范圍選擇性較低，而且動物組織中的蛋白（最大吸收波長為280 nm左右）及其他共萃取物極易對分析過程產生干擾，容易造成誤判現象。

磺胺類藥物分子中磺酰胺的對位氨基（伯胺）活潑性高，可與衍生試劑熒光胺進行反應，生成具有熒光特性的磺胺衍生物，而非伯胺類化合物不發(fā)生類似反應。通常，在酸性條件下，熒光胺中的氧原子被質子化后，帶有正電荷，向相鄰環(huán)的碳原子吸引電子，削弱了C－O鍵，內酯環(huán)開環(huán)，使碳原子帶有部分正電荷，溶液中的水進攻碳正離子，然后失去氫離子，得到環(huán)氧化合物繼續(xù)質子化、異構化，得到中間體羰基化合物；然后磺胺中活潑的伯氨基與中間體化合物的羰基發(fā)生縮合反應，成環(huán)，最終得到磺胺衍生物（圖1）。

圖1 磺胺類藥物與熒光胺可能的反應機理Fig. 1 Possible reaction mechanism between sulfonamides and fluorescamine

熒光胺與磺胺類藥物發(fā)生衍生化反應，產物具有很高的熒光強度，利用熒光檢測器測定，可有效降低其他組分的干擾，提高檢測的靈敏度和可靠性。但由于該衍生化產物性質不穩(wěn)定，會隨著時間延長逐漸分解，需要在短時間內完成測定，否則容易影響定量的準確性，這對批量檢測樣品工作帶來極大不便。鑒于熒光衍生產物易分解，導致定量不準確、批量檢測工作不方便等原因，針對目前磺胺類藥物多殘留檢測的實際需要，本研究根據磺胺類藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應機理，對影響衍生化反應的各個因素系統(tǒng)地進行選擇、優(yōu)化，確定維持衍生化反應產物穩(wěn)定性的方法。對豬肉樣品的磺胺-熒光胺衍生產物經高效液相色譜法測定，大大提高了方法的準確度和實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 份豬肉樣品，均隨機購自青島市各農貿市場。

熒光胺（純度≥99%） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；KHPO（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

磺胺類藥物標準品：磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，SM2’，純度94.0%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD，純度99.1%）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2，純度99.4%）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM，純度98.0%）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ，純度99.3%）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfamethoxydiazine，SMD，純度98.0%）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO，純度99.1%）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMZ，純度99.5%）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM，純度99.4%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；磺胺甲氧吡嗪（sulfamethoxypyrazine，SMPZ，純度98%） 加拿大TRC公司；磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，STX，純度99.8%） 澳大利亞國家計量研究院。

1.2 儀器與設備

e2695高效液相色譜儀（配備Waters 2475熒光檢測器） 美國Waters公司；Centrifuge 5804 R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MilliQ超純水儀 美國Millipore公司；N-EVAP 112氮吹儀美國Organomation公司；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

磺胺類藥物標準儲備液（100 μg/mL）：精密稱取各磺胺類藥物標準品2.5 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，－20 ℃保存?；前奉愃幬锘旌蠘藴使ぷ饕海?.0 μg/mL）：準確量取各標準儲備液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度?；前奉愃幬锘旌蠘藴使ぷ饕海?.1 μg/mL）：準確量取1.0 μg/mL的混合標準工作液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度。－20 ℃保存。

提取溶液（0.1 mol/L KHPO）：取KHPO6.80 g，用超純水溶解并定容至500 mL。

衍生溶液（0.1 mol/L KHPO，pH 3.0）：取KHPO0.68 g，超純水溶解，并用0.1 mol/L HPO溶液調節(jié)pH值至3.0，最后用超純水定容至50 mL。

衍生試劑（0.3 mg/mL熒光胺）：精確稱取熒光胺7.50 mg，丙酮溶解并定容至25 mL。

1.3.2 樣品前處理

取豬肉樣品，經勻漿制備成肉糜狀，準確稱取（5.00±0.01） g于50 mL具塞離心管中，加入提取液10 mL，多管渦旋儀渦旋5 min，8 000 r/min離心8 min后倒出上清液；重復提取1 次，合并上清液，混勻；取5 mL合并后的上清液，加入經3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB固相萃取柱，分別用3 mL水和3 mL體積分數20%甲醇水溶液淋洗，真空抽干后用3 mL甲醇洗脫，45 ℃水浴氮氣吹干，待用。

1.3.3 衍生化反應

經前處理后的樣品，加入0.1 mol/L KHPO（pH 3.0）溶液0.8 mL渦旋溶解，再加入0.3 mg/mL熒光胺溶液0.2 mL，混合均勻后，4 ℃條件下反應40 min，待測。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長：激發(fā)波長405 nm，發(fā)射波長495 nm；流動相：A為體積分數0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，流動相A體積分數66%；3.0～15 min，流動相A體積分數線性變化至60%；15～30 min，流動相A體積分數保持60%；30～33 min，流動相A體積分數線性變化至66%；33～35 min，流動相A體積分數保持66%。

1.4 數據處理

折線圖采用Graphpad Prism 5軟件繪制；色譜圖采用Waters Empower 2工作站進行數據采集和處理，自動計算擬合線性回歸曲線。

2 結果與分析

2.1 衍生化反應條件優(yōu)化

磺胺類藥物中含有芳香伯氨基，在酸性溶液中加入一定濃度的熒光胺衍生試劑，11 種磺胺類藥物都顯示出良好的反應活性，室溫下反應40 min衍生產物峰面積最大，并基本穩(wěn)定，但是，隨著時間的延長，衍生產物會發(fā)生降解，24 h后基本衰減完全，嚴重影響準確定量。為了更好地應用于日常檢測工作，本研究根據衍生化反應可能發(fā)生的反應機理，對該衍生化反應條件加以優(yōu)化。主要從衍生溶液pH值、衍生反應時間、熒光胺質量濃度等方面進行研究，以期得到最優(yōu)反應條件。

2.1.1 衍生溶液pH值對峰面積的影響

根據磺胺與熒光胺的反應機理，衍生溶液的pH值對衍生化反應的影響至關重要，分別對不同pH值條件下（pH 3.0、7.0、10.0）衍生化產物峰面積進行比較。在堿性條件下（pH 10.0），衍生化產物幾乎沒有響應；在中性條件下（pH 7.0）響應很微弱，而在酸性條件下（pH 3.0）響應明顯增強。

為進一步確認最佳溶液pH值，在pH 2.0～7.0做加密測試，由圖2可知，在pH 2.0～5.0范圍內均可獲得較強的熒光強度，而且低pH值條件可降低熒光產物的衰減速率，因此，選擇pH 3.0的KHPO緩沖溶液。

圖2 衍生溶液pH值（A）、反應時間（B）和熒光胺質量濃度（C）對峰面積的影響Fig. 2 Effect of pH value (A)， reaction time (B) and fluoramine concentration (C) on the peak areas

2.1.2 衍生反應時間對峰面積的影響

比較衍生化反應0～100 min產物的峰面積，由圖2可知：反應時間0～40 min時，隨著時間延長，峰面積增大；40～80 min峰面積趨于穩(wěn)定，80 min后衍生產物峰面積開始下降，因此，選擇40 min作為衍生化反應時間。

2.1.3 熒光胺質量濃度對峰面積的影響

不同質量濃度熒光胺溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）對衍生反應有影響。由圖2可知，隨著熒光胺質量濃度的升高，衍生化產物峰面積逐漸增大，當熒光胺質量濃度達到0.3 mg/mL時，峰面積達到最大并趨于穩(wěn)定，因此，選用0.3 mg/mL熒光胺溶液。

2.1.4 衍生產物的反應條件對峰面積的影響

磺胺-熒光胺衍生產物穩(wěn)定性差，室溫下長時間放置衍生產物會逐漸衰減，對準確定量造成影響。為此，衍生化后的樣品分別在室溫和4 ℃下避光保存，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、15.0、18.0 h測定。室溫條件下，衍生產物在80 min內穩(wěn)定，隨后開始降解（圖2和圖3）；而在4 ℃條件下，衍生產物在12 h內維持穩(wěn)定，未出現顯著衰減情況（圖3）。因此，本方法采用低溫條件進行反應和檢測，可實現批量樣品的篩查分析。

圖3 室溫（A）和4 ℃（B）下放置時間對峰面積的影響Fig. 3 Effect of storage time at room temperature (A) and 4 ℃ (B) on the peak areas

2.2 色譜條件優(yōu)化

11 種磺胺類藥物具有相似的化學結構，且SMM與SMD、SDO與SDM互為同分異構體，增加了液相色譜分離的難度?？疾靀Bridge Shield RP 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱對目標化合物的分離效果。結果表明，3 種色譜柱均能有效保留11 種化合物，但XBridge Shield RP 18和Symmetry C（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果不好，色譜峰得不到完全分離。而Symmetry C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）在35 min內可有效分離11 種磺胺類藥物。圖4為該色譜柱條件下空白豬肉樣品和空白豬肉添加11 種磺胺類藥物后的色譜圖。

圖4 空白豬肉（A）和空白豬肉添加11 種磺胺類藥物（2.0 μg/kg）（B）的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of blank pork (A) and 11 sulfonamides added to blank pork samples at 2.0 μg/kg (B)

2.3 方法學評價

2.3.1 標準曲線、相關系數、檢出限和定量限

配制不同質量濃度（1、5、10、20、50、100、200 μg/L）的11 種磺胺類藥物混合標準溶液，按照1.3.3節(jié)方法衍生化后，經高效液相色譜-熒光檢測器檢測，以各藥物峰面積（）為縱坐標，標準溶液質量濃度（，μg/L）為橫坐標，進行線性回歸。

由表1可知，11 種磺胺類藥物在1～200 μg/L質量濃度范圍內呈現良好的線性關系（≥0.999 4）。分別以3 倍和10 倍信噪比對應的質量濃度，計算本方法測定豬肉樣品中磺胺類藥物的檢出限和定量限，其中SM2’、SD、SM2、SMM、STZ和SMD的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為0.8 μg/kg，SMPZ、SDX、SMZ和STX的檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，SDM的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.6 μg/kg。

表1 11 種磺胺類藥物的回歸方程及相關系數Table 1 Regression equations and correlation coefficients (R2) of the 11 sulfonamides

2.3.2 準確度、精密度和靈敏度

在空白豬肉中添加11 種磺胺類藥物混合標準工作液，加標量分別為2、50、100 μg/kg，進行加標回收實驗，考察方法的加標回收率、日內和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。由表2可知，11 種磺胺類藥物的平均加標回收率為62.0%～108.0%，日內RSD為2.0%～8.8%，日間RSD為1.8%～8.6%。

表2 空白豬肉中11 種磺胺類藥物的平均加標回收率、日內和日間相對標準偏差Table 2 Average recoveries， intra-day and inter-day relative standard deviation (RSD) of the 11 sulfonamides in blank pork samples %

2.4 方法比較

本研究比較了高效液相色譜-紫外法、柱前和柱后衍生高效液相色譜-熒光法測定豬肉中磺胺類藥物殘留量的方法，其中，高效液相色譜-紫外法選擇性低，雜峰干擾明顯，信號峰弱；柱后衍生法是在線衍生，從進樣器吸取樣品到檢測器檢測到信號，磺胺類藥物不能在短時間內完全反應，熒光響應值明顯低于柱前衍生法。磺胺與熒光胺反應得到的衍生化產物穩(wěn)定性差，有文獻報道要在1 h內完成測定，否則會影響定量的準確性；而在本研究中，4 ℃條件下衍生化產物維持12 h不發(fā)生衰減。綜上，在本研究條件下，方法的定量限低（0.8～1.6 μg/kg）、雜質干擾程度低、信號峰響應高、重現性好，提高了方法的準確性和批量操作的可靠性。

2.5 方法應用

使用GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》和本方法對青島市各農貿市場隨機抽取的50 份豬肉樣品中磺胺類藥物殘留進行測定，結果表明，有1 份樣品SM2為陽性，2 種方法測定得到樣品中SM2的殘留量分別為190、192 μg/kg，無明顯差異，表明本方法準確、可靠，可用于基層豬肉樣品中磺胺類藥物殘留的檢測。

3 結 論

根據磺胺類藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應機理，對衍生化反應條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，建立熒光胺柱前衍生-高效液相色譜檢測豬肉中11 種磺胺類藥物殘留的分析方法。該方法靈敏度高、重復性好而且對儀器設備要求不高，操作快速簡便，可用于畜產品質量安全監(jiān)測，如批量樣品中磺胺類藥物殘留的篩查和確證工作，為基層一線的實際檢測提供可靠的技術支持。