磷酸鹽-大豆分離蛋白聯(lián)合處理對(duì)草魚肌原纖維蛋白凝膠化的影響

張鈺嘉，萬楊卓群，石尚軒，周圣嵐，郭金鑫，朱 杰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院生物物理研究所，陜西 楊凌 712100）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)深加工水產(chǎn)品（魚糜產(chǎn)品）的需求也逐年升高。在我國(guó)，草魚屬于大宗淡水魚類，因養(yǎng)殖量巨大且價(jià)格低廉，已成為魚糜制品的主要加工原料之一。肌原纖維蛋白占總肌肉蛋白的55%～65%，不僅作為魚糜制品的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，也在生產(chǎn)加工中起著膠凝劑的作用，主要影響肉制品的質(zhì)構(gòu)特性和持水能力。因此，如何改善肌原纖維蛋白凝膠化已成為魚糜制品工業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

磷酸鹽和大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為優(yōu)良的食品添加劑，在魚糜制品生產(chǎn)加工中起著重要作用。相關(guān)研究顯示，高鈉鹽攝入與高血壓等心血管疾病直接相關(guān)。多聚磷酸鹽可作為鈉鹽的替代物，是常見的食品添加劑，可以顯著提高肌球蛋白的黏結(jié)性，進(jìn)而提高蛋白凝膠特性并顯著改善肉制品的功能特性。另外，植物性蛋白（豆類蛋白）被認(rèn)為是提高肉制品質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的潛在替代品。SPI的加入可有效改善肉制品的組織結(jié)構(gòu)和乳化性狀。相關(guān)研究顯示，添加SPI后，復(fù)合蛋白的持水性、乳化活性/穩(wěn)定性和硬度均顯著高于純肌原纖維蛋白，且添加量越大，增強(qiáng)效果越顯著。但是，磷酸鹽和SPI在作為食品品質(zhì)改良劑時(shí)也同樣存在缺點(diǎn)：添加過多磷酸鹽會(huì)降低肉制品的食用品質(zhì)，甚至還會(huì)危害人體健康；SPI的變性溫度遠(yuǎn)高于普通肉制品加熱的最高溫度，使其在加熱過程中不能與肌原纖維蛋白充分相互作用。本研究擬探討磷酸鹽-SPI聯(lián)合處理對(duì)草魚肌原纖維蛋白凝膠化的影響，以兼顧二者在優(yōu)化魚糜產(chǎn)品凝膠特性中的優(yōu)勢(shì)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)康樂市場(chǎng)選取個(gè)體質(zhì)量為（1.0±0.1） kg、生存狀態(tài)相近的草魚15 條，宰后30 min內(nèi)直接用于肌原纖維蛋白提取，或經(jīng)液氮速凍后保存于（－80.0±2.0） ℃超低溫冰箱，備用。

SPI、考馬斯亮藍(lán) 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHMP）廣東光華科技股份有限公司；焦磷酸鈉（tetrasodium pyrophosphate，TSPP） 天津博迪化工股份有限公司；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）成都科龍化工試劑廠；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Trishydrochloride，Tris-HCl） 美國(guó)Sigma公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-160HR高速冷凍離心機(jī) 安徽科大中佳公司；MSC-100恒溫振蕩金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；Multimode-8原子力顯微鏡 美國(guó)Bruker公司；FE20酸度計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；C-LM4肌肉嫩度儀北京天域飛翔公司；NDJ-79A旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海昌吉地質(zhì)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚肌原纖維蛋白復(fù)合凝膠制備

參考曾淑薇、張登科等的方法經(jīng)細(xì)微調(diào)整后提取草魚肌原纖維蛋白，使用預(yù)冷試劑及冰浴，以保證全程于4 ℃條件下進(jìn)行。新鮮草魚經(jīng)攪碎成魚糜后與5 倍體積的低鹽緩沖液（0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）均勻混合，8 000×離心10 min后，用去離子水漂洗3 次；然后用4 倍體積高鹽緩沖液（0.45 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）在4 ℃條件下浸提22 h，4 層紗布過濾，8 000×離心15 min，沉淀即為草魚肌原纖維蛋白。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，并用生理鹽水稀釋至1 mg/mL。取1 mg/mL草魚肌原纖維蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.5，放入80 ℃恒溫水浴加熱40 min，冰浴降溫形成凝膠，置于4 ℃冰箱中孵育2 h。

將質(zhì)量濃度均為1.2 g/100 mL的TSPP、SHMP和STPP分別與質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的SPI以體積比1∶2溶于生理鹽水，得到磷酸鹽-SPI混合液，作為復(fù)合處理草魚肌原纖維蛋白所用試劑。配制0.9、1.2、1.5 g/100 mL的磷酸鹽溶液及5 g/100 mL的SPI溶液，作為單一對(duì)照處理草魚肌原纖維蛋白所用試劑。將復(fù)合處理所用磷酸鹽-SPI混合液或?qū)φ仗幚硭昧姿猁}及SPI溶液按照體積比1∶4加入到1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.5，80 ℃加熱40 min制備凝膠，并進(jìn)行持水性、嫩度、黏度及超微形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

用質(zhì)量濃度分別為0.9、1.2、1.5 g/100 mL的磷酸鹽與5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理肌原纖維蛋白，步驟同上。選擇結(jié)果較好的凝膠組作為目標(biāo)磷酸鹽實(shí)驗(yàn)組。按磷酸鹽種類不同將復(fù)合處理分為3 組：1.2 g/100 mL TSPP、5 g/100 mL SPI體積比1∶1、1∶2、1∶3處理組；1.2 g/100 mL SHMP、5 g/100 mL SPI體積比1∶1、1∶2、1∶3處理組；1.2 g/100 mL STPP、5 g/100 mL SPI體積比1∶1、1∶2、1∶3處理組。

1.3.2 凝膠特性與超微結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 凝膠持水性測(cè)定

稱取一定質(zhì)量草魚肌原纖維蛋白凝膠于10 mL離心管中，4 ℃條件下4 500 r/min離心10 min后除去多余水分，測(cè)定凝膠離心前后質(zhì)量。重復(fù)測(cè)定3 次取平均值。持水性按下式計(jì)算。

式中：為離心管質(zhì)量/g；為離心前離心管和凝膠質(zhì)量/g；為離心后離心管和凝膠質(zhì)量/g。

1.3.2.2 凝膠力學(xué)特性測(cè)定

取長(zhǎng)×寬×高不小于6 cm×3 cm×3 cm的整塊凝膠，用直徑1.27 cm柱形取樣器取樣，孔樣長(zhǎng)度為3 cm。將孔樣置于肌肉嫩度儀上，孔樣剪切力峰值扣除空載剪切力峰值，即為孔樣剪切力測(cè)定值。每個(gè)處理組取3 塊凝膠樣，測(cè)得凝膠的平均剪切力。

將凝膠樣品置于高速組織搗碎機(jī)，經(jīng)粉碎后置于4 ℃恒溫容器內(nèi)，將同軸測(cè)量圓筒放入旋轉(zhuǎn)黏度儀測(cè)量容器進(jìn)行測(cè)定，取3 次測(cè)定平均值為樣品黏度。

1.3.2.3 凝膠超微結(jié)構(gòu)表征

將處理后的草魚肌原纖維蛋白溶液稀釋200 倍，取10 μL稀釋液滴于新鮮解理的云母片上，置于80 ℃水浴鍋中恒溫加熱40 min，并在4 ℃條件下防塵干燥2 h，最終得到凝膠樣品。利用原子力顯微鏡對(duì)凝膠樣品進(jìn)行成像，掃描模式為ScanAsyst智能模式，掃描面積2.0 μm× 2.0 μm，掃描頻率0.997 Hz。凝膠表面粗糙度由均方根粗糙度（）表示，由離線軟件Nanoscope Analysis V1.10（美國(guó)Bruker公司）基于原子力顯微鏡高度圖像進(jìn)行計(jì)算分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010軟件及Minitab 15軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Excel 2010軟件記錄數(shù)據(jù)、繪制圖表，利用Minitab 15軟件采用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類磷酸鹽處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠特性

2.1.1 不同種類磷酸鹽處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠宏觀特性

持水性是魚糜制品的重要物理參數(shù)，體現(xiàn)魚糜蛋白的保水能力，與蛋白體系的交聯(lián)情況有關(guān)。黏度表示樣品流動(dòng)阻力的大小，分散體的黏度隨著分子尺寸的增加而增加。

由表1可知，添加1.2 g/100 mL磷酸鹽后，TSPP組較STPP及SHMP組能夠顯著提高草魚肌原纖維蛋白凝膠的持水性及嫩度（＜0.05）。

表1 不同種類磷酸鹽處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 1 Gel properties of MP with addition of different phosphates

2.1.2 不同種類磷酸鹽處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠微觀表面結(jié)構(gòu)

熱誘導(dǎo)凝膠在形成過程中，肌原纖維蛋白的主要成分肌球蛋白受熱而變性展開，松散的蛋白進(jìn)而因降溫時(shí)的聚合作用相互交聯(lián)，最終形成較大分子的凝膠體，并把水分子包裹在其中。凝膠基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性的差異主要取決于變性和聚集的相對(duì)速率，蛋白的聚集速率相對(duì)展開速率越慢，就越有利于蛋白的定向，最終會(huì)呈現(xiàn)出更加細(xì)致的凝膠網(wǎng)絡(luò)；反之，則形成粗糙、無序的凝膠結(jié)構(gòu)或凝結(jié)物。

由圖1可知，1.2 g/100 mL TSPP處理組草魚肌原纖維蛋白凝膠的表面顆粒更加分散、表面高度差更小，該組蛋白凝膠顆粒的大?。ざ龋┮草^為適中（表1，＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，不同種類磷酸鹽加入均使凝膠表面顆粒明顯分散化，呈現(xiàn)出更加規(guī)律的排布。由此推斷，加入不同種類磷酸鹽均可增大草魚肌原纖維蛋白分子間的靜電斥力，聚集速率降低，致使蛋白分子充分展開；之后的熱處理則使蛋白緩慢聚集，變性鏈定向趨于有序化，從而使凝膠的微觀表面細(xì)致、均勻，形成較為規(guī)律的微觀結(jié)構(gòu)。磷酸鹽改善凝膠性質(zhì)的另一原因在于離子與帶正電荷的相鄰肽鏈發(fā)生相互作用，從而穩(wěn)定蛋白交聯(lián)，導(dǎo)致更有序和更緊密凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，使凝膠具有更高的強(qiáng)度和持水性。在pH 7.5條件下，磷酸鹽的加入會(huì)在蛋白表面形成電子層，促進(jìn)蛋白肽鏈間氫鍵的穩(wěn)定，從而增強(qiáng)蛋白的溶解度和微觀有序程度，使蛋白與水的相互作用增多，有利于蛋白形成穩(wěn)定、有序的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)并保存水分。這一過程在表1中則體現(xiàn)為：相較空白對(duì)照組，不同種類磷酸鹽加入均使凝膠持水性顯著提升。微觀表面掃描圖（圖1）顯示，凝膠表面顆粒從聚集成團(tuán)向分散均勻發(fā)生轉(zhuǎn)變。

圖1 不同種類磷酸鹽處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠的微觀表面結(jié)構(gòu)Fig. 1 Microscopic surface structure of MP gels with addition of different phosphates

綜合宏觀及微觀測(cè)定結(jié)果，較其他種類磷酸鹽處理，1.2 g/100 mL TSPP處理組具有最好的凝膠特性（高保水性、高嫩度、黏度適中、表面均勻）。

2.2 不同質(zhì)量濃度TSPP-5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠特性

2.2.1 不同質(zhì)量濃度TSPP-5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠宏觀特性

當(dāng)添加SPI時(shí)，肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性增加，凝膠的保水能力顯著提升。SPI加入提高凝膠品質(zhì)可能是由于其為周圍水分子提供更多的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)氫鍵和二硫鍵，使蛋白間交聯(lián)程度增大，作為肌原纖維蛋白間連接的中間體，提高了蛋白凝膠體系的穩(wěn)定性，這與草魚肌原纖維蛋白凝膠宏觀測(cè)定結(jié)果一致。由圖2可知，1.2 g/100 mL TSPP-5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理使凝膠剪切力最小，嫩度最大（＜0.05）；由圖3可知，磷酸鹽-SPI復(fù)合處理較單一處理，凝膠持水性明顯升高，表明復(fù)合處理較單一處理對(duì)于草魚肌原纖維蛋白凝膠品質(zhì)具有顯著改善作用，但不同比例的磷酸鹽、SPI復(fù)合處理對(duì)持水性改變不大；由圖4可知，隨著5 g/100 mL SPI添加量的增大，0.9 g/100 mL TSPP復(fù)合處理組凝膠黏度呈上升趨勢(shì)，而1.2 g/100 mL TSPP復(fù)合處理組凝膠黏度呈下降趨勢(shì)，1.5 g/100 mL TSPP復(fù)合處理組凝膠黏度先上升后下降，僅A2組和B3組的黏度較為適中（＜0.05），表明在較低離子強(qiáng)度條件下，SPI可使蛋白分子間交聯(lián)程度增大，較高離子強(qiáng)度時(shí)則降低蛋白交聯(lián)程度或?qū)宦?lián)程度影響無規(guī)律。

圖2 不同處理?xiàng)l件下草魚肌原纖維蛋白凝膠剪切力Fig. 2 Shear force of MP gels under different treatments

圖3 不同處理?xiàng)l件下草魚肌原纖維蛋白凝膠持水性Fig. 3 WHC of MP gels under different treatments

圖4 不同處理?xiàng)l件下草魚肌原纖維蛋白凝膠黏度Fig. 4 Viscosity of MP gels under different treatments

1.2 g/100 mL TSPP-5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理可使草魚肌原纖維蛋白凝膠具有較好的持水性、嫩度及黏度。磷酸鹽-SPI復(fù)合處理有助于提高草魚肌原纖維蛋白凝膠品質(zhì)。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度TSPP-5 g/100 mL SPI聯(lián)合處理后草魚肌原纖維蛋白凝膠微觀表面結(jié)構(gòu)

磷酸鹽與蛋白的結(jié)合能力與其鏈長(zhǎng)有關(guān)，鏈長(zhǎng)較短的TSPP可能具有更高的反應(yīng)靈活性。由圖1a、d及圖5可知，隨著TSPP質(zhì)量濃度的增加，蛋白顆粒從聚結(jié)在一起變?yōu)楦由煺埂⒎稚?，這有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于形成更為有序、表面更加平緩、多孔且孔徑均一的細(xì)致結(jié)構(gòu)。其中，1.2 g/100 mL磷酸鹽處理后的凝膠表面蛋白較其他質(zhì)量濃度磷酸鹽處理組更規(guī)則、平整；SPI使凝膠表面顆粒更分散，磷酸鹽使凝膠表面更平整；B3組凝膠品質(zhì)最優(yōu)。原子力顯微鏡掃描圖可直觀展示樣品表面蛋白顆粒分散情況及蛋白顆粒高度，高度差越小、顆粒越分散，則表明樣品表面越平整、均勻。與圖1a顯示的空白對(duì)照組表面形貌對(duì)比，在加入SPI后，凝膠表面顆粒分布更加均勻，但由于蛋白量的增大，凝膠表面高度差也較大（圖6，空白對(duì)照組、5 g/100 mL SPI組）。較低質(zhì)量濃度的磷酸鹽（0.9 g/100 mL TSPP）加入后，凝膠表面蛋白趨于分散化（圖5B）；TSPP處理較SPI、STPP及SHMP處理更有利于蛋白的分散，使凝膠具備更低的表面粗糙度（圖1b、c、d、圖5a、圖6）。不同處理組間對(duì)比結(jié)果顯示，B3組凝膠表面最為平整、有序（圖5d、e、f），且凝膠表面粗糙度最低（＜0.05，圖6）。

圖5 不同處理方式下草魚肌原纖維蛋白凝膠的微觀表面結(jié)構(gòu)Fig. 5 Microscopic surface structure of MP gels with different treatments

圖6 不同處理方式下草魚肌原纖維蛋白凝膠表面粗糙度Fig. 6 Surface roughness of MP gels with different treatments

3 結(jié) 論

磷酸鹽促進(jìn)了草魚肌原纖維蛋白凝膠的有序性，SPI增大了蛋白間交聯(lián)程度，二者共同配合提升了草魚肌原纖維蛋白凝膠的品質(zhì)。綜合宏觀及微觀結(jié)果，較其他處理組而言，1.2 g/100 mL TSPP、5 g/100 mL SPI體積比1∶3處理組可使草魚肌原纖維蛋白凝膠具有嫩度大、持水性好、黏性適中、粗糙度小、結(jié)構(gòu)平整有序的特點(diǎn)，表明該種處理方式能夠顯著提高草魚肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)，是更好的草魚肌原纖維蛋白凝膠處理方案，生產(chǎn)者可考慮采取該種處理方式提高草魚魚糜凝膠產(chǎn)品的品質(zhì)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝。

不同來源的肌原纖維蛋白，其理化性質(zhì)及含量存在差異，本研究?jī)H探討了磷酸鹽、SPI對(duì)草魚肌原纖維蛋白凝膠化的影響，未涉及其他種類來源的肌原纖維蛋白。在探究其他來源肌原纖維蛋白相關(guān)性質(zhì)時(shí)，可采用多種方式（如使用掃描電子顯微鏡觀察、牽拉蛋白凝膠并檢測(cè)力學(xué)特性變化等）研究不同處理?xiàng)l件對(duì)不同來源肌原纖維蛋白熱凝膠品質(zhì)的影響。