5-脂加氧酶在胃癌中的表達與環(huán)氧化酶-2和甲酰肽受體2的關系及其臨床意義

李 慶，徐 芬，雷 浪，李里香，郝 華，3

1.南昌大學第二附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006；

2.南昌大學第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科，江西 南昌 330006；

3.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院病理科，上海 200090

胃癌是我國最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率在男性居第2位，女性居第3位［1］，晚期胃癌患者5年生存率低，預后差［2］，手術是其治療的主要手段［3］。而其發(fā)病機制未完全闡明，研究胃癌侵襲、轉移過程中的關鍵分子對胃癌的防治具有重要意義。眾所周知，慢性炎癥與腫瘤的關系密切，長期慢性炎癥經久不愈、持續(xù)刺激可導致上皮細胞增殖過程中的惡性轉化，如慢性結腸炎與結腸癌，慢性病毒性肝炎與肝癌。而且研究表明，幽門螺旋桿菌的感染參與了胃癌的發(fā)生過程。胃炎發(fā)展過程中伴有炎癥因子的釋放，炎癥因子又可激活炎癥細胞，導致活性氧類（ROS）生成增多，進而誘導上皮細胞增生。花生四烯酸（AA）代謝通路的激活參與了胃炎的發(fā)生發(fā)展過程。研究結果發(fā)現(xiàn)，AA 通過環(huán)氧合酶途徑（COX）或脂氧合酶（LOX）兩種途徑代謝產生了較多的AA 類產物，而這些產物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［3］。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)，脂氧素（lipoxin，LX），通過跨細胞途徑，脂加氧酶催化生成，是體內最重要的抗炎、促消退物質具有抗腫瘤作用，而其受體為甲酰肽受體2（FPR2）。本研究采用免疫組化法檢測胃癌組織中5-脂加氧酶（5-LOX）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）與FPR2 的表達，探討5-LOX 的表達與胃癌臨床病理學特征及COX-2和FPR2 表達的關系，旨在為胃癌的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015 年1 月—2016 年12 月南昌大學第二附屬醫(yī)院病理科存檔的胃癌手術切除標本70例（均通過院倫理委員會審核）。所有患者臨床及病理資料完整，術前均未行放化療。研究對象中≤45 歲25例，>45 歲45 例，病理類型中，低分化管狀腺癌15例，中-高分化管狀腺癌45 例，黏液腺癌10 例。根據第八版AJCC 胃癌病理分期標準對病例進行分期，其中Ⅰ-Ⅱ期患者48 例，Ⅲ-Ⅳ期患者22 例；其中有淋巴結轉移者31例，無淋巴結轉移者39例。

1.2 試劑與方法

所有標本經固定、脫水，包埋處理，4 μm 厚連續(xù)切片，進行蘇木精-伊紅（HE）及免疫組化染色。免疫組化染色采用En Vision 兩步法，采用高溫高壓法修復抗原，DAB 顯色。5-LOX 為兔抗單克隆抗體，甲酰肽受體2（FPR2）為鼠抗單克隆抗體，均購自美國Abcam 公司，稀釋濃度均為1∶100；COX-2兔抗單克隆抗體（為即用型）購于北京中杉公司。人胃癌細胞株SGC-790l 購自中科院上海細胞生物學研究所，5-LOX 沉默質粒由南通麥杰生物科技有限公司設計并合成，sh5-LOX 沉默靶點序列為5’-CGGGAGATGAGAACCCTATTT-3’， shRNANC 序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Taq 酶購自日本TaKaRa 公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。

1.3 結果判斷

胃癌的診斷由兩位高年資病理醫(yī)生雙盲閱片。各指標的陽性表達以胞膜或胞質內出現(xiàn)淺黃色或棕黃色顆粒為陽性，結果判斷采用二級計分法。陽性細胞數計分標準：<5%為0 分、5%～25%為1 分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；染色強度計分標準：0為陰性、淺黃色為1分、黃色或深黃色為2 分，褐色或深褐色為3 分。最終評分將陽性細胞數計分和染色強度計分兩者相乘，結果判斷標準為：0～3分為陰性，>3分為陽性。

1.4 細胞實驗

SGC-7901 細胞用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)、傳代。選擇第3代對數生長期細胞接種于六孔板，采用Lipofectamine2000進行轉染，具體操作按說明書進行。將細胞分為空白對照組、空質粒組（shNC）、轉染組（sh5-LOX）。

1.5 RT-PCR檢測細胞mRNA表達

采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，具體操作按說明書進行。紫外分光光度計測定RNA 含量及純度，先將RNA 逆轉錄為cDNA，再進行PCR 擴增。PCR 擴增體系總體積為25 μL，具體反應條件見表1。

1.6 統(tǒng)計學分析

免疫組化結果采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。5-LOX 表達與患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。5-LOX 表達與COX-2、FPR2 表達的相關性采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。所有檢驗P值均為雙側。

2 結果

2.1 5-LOX 表達與患者年齡、胃癌腫塊大小及病理類型的關系

5-LOX 在≤45 歲組與>45 歲組中的陽性表達率分別為76.0%和84.4%；在腫塊直徑<3 cm 組與腫塊直徑>3 cm 組中的陽性表達率分別為82.1%和81.0%；在低分化管狀腺癌、中-高分化管狀腺癌及粘液腺癌中的陽性表達率分別為80.0%、80.0%和90.0%（圖1，表2），不同組別間差異經統(tǒng)計學分析均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 5-LOX表達與淋巴結轉移及TNM分期的關系

5-LOX 在無、有淋巴結轉移組陽性率分別為71.8%和93.5%（圖1，表2）；在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期胃癌組織中5-LOX 的陽性表達率分別為75.0%和95.5%（圖1，表1），差異經統(tǒng)計學分析提示均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 引物序列及反應條件Tab.1 PCR primer sequences and reaction conditions

圖1 5-LOX在腺癌中的表達Fig.1 The expression of 5-LOX in adenocarcinoma

2.3 5-LOX表達與COX-2、FPR2表達的相關性

5-LOX 在COX-2 陽性和陰性病例中陽性率分別為81.6%和81.0%（圖1、2，表2）；5-LOX 在FPR2陽性和陰性病例中陽性率分別為78.1%和84.2%（圖1、3，表2），差異經統(tǒng)計學分析提示均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 5-LOX 表達與臨床病理特征、COX-2 及FPR2 表達的關系 ［n （%）］Tab. 2 The relationships of 5-LOX expression with clinicopathological features， COX-2， and FPR2 expressions ［n （%）］

2.4 沉默5-LOX 基因表達后對COX-2 及FPR2 mRNA表達的影響

沉默5-LOX 基因后，5-LOX mRNA 幾乎不表達，但 對COX-2 及FPR2 mRNA 表 達 沒 有 影 響，COX-2 及FPR2 mRNA 在SGC-790l 細 胞 中依 舊 高表達（圖4）。這說明，5-LOX 與COX-2 及FPR2 不存在相互作用，與臨床標本檢測結果一致。

3 討論

流行病學研究發(fā)現(xiàn)，長期服用非甾體類抗炎藥（NSAIDs）可明顯降低實體瘤的發(fā)生率。NSAIDs 具有明顯的抗炎作用，需要通過作用于AA 的代謝途徑而發(fā)揮其功能。AA 是屬于二十碳不飽和脂肪酸，為細胞膜磷脂的組成部分。當致炎因子和抗原刺激機體時，可引起細胞膜代謝紊亂，直接導致了膜磷脂酶A2（PLA2）被激活，細胞膜中的磷脂被水解進而生成游離的AA。AA接著被少許攝取再一次成為酯化的AA，大部分則通過代謝酶轉化為其他產物。AA 的代謝有3 條途徑：（1）通過脂氧合酶途徑（LOXs）生成白三?。↙Ts）、氫二十碳四稀酸（HETEs）和脂氧素，最重要的酶是5-LOX；（2）通過環(huán)氧合酶途徑（COXs）生成各種前列腺素（PGs），最重要的酶是COX-2；（3）合成環(huán)氧化二十碳四稀酸（EETs）（細胞色素P450途徑）。AA代謝所產生的產物統(tǒng)稱為類花生酸，這些產物與腫瘤的生長及侵襲密切相關［4］。

圖2 COX-2在腺癌中的表達Fig.2 The expression of COX-2 in adenocarcinoma

LOXs可催化花生四烯酸和亞油酸的氧化，氧化的脂質可以通過細胞表面受體或生成的脂質介質激活細胞信號通路而引起生物學效應（促腫瘤或抑腫瘤）。根據LOXs 對底物作用位置的不同，分為5-LOX，8-LOX，12-LOX 及15-LOX 四個亞型，其中5-LOX是LOXs中的重要一員。人5-LOX 基因位于10號染色體，包含外顯子和內含子分別為14 個和13個。通過對5-LOX 啟動子分析，5-LOX 啟動子與一些看家基因的啟動子序列相似，其核心啟動子有一獨特的富含GC 區(qū)，包含5 個spl 結合序列串。啟動子區(qū)還包含轉錄因子NF-κB，AP-2和c-myb癌基因的共有序列。5-LOX 是AA 代謝的關鍵酶，催化AA生成5-羥基二十碳四烯酸（5-HETE），5-HETE進而轉化為白三烯A4（LTA4），LTA4在LTA4水解酶的作用下轉化為白三烯B4（LTB4）。研究［5］表明LOXs 與許多腫瘤有關，例如肺癌、前列腺癌、結腸癌、乳腺癌及胰腺癌，然而其導致腫瘤的機制研究的比較少。Hennig 等［6］研 究 表 明 在 胰 腺 癌 細 胞 株AsPC-1、PANC-1 及MiaPaCa2 中有5-LOX mRNA，然而正常胰管細胞株中則沒有，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)5-LOX及其下游代謝產物LTB4 在胰腺癌中的表達明顯高于正常胰腺組織。Ding等［7］研究發(fā)現(xiàn)，5-HETE可以激活MEK/ERK 及PI3K/AKT 通路。雒鈺杰等［8］研究發(fā)現(xiàn)，敲低花生四烯酸5 脂加氧酶（Alox5）基因促進K562/ADM 細 胞 凋 亡。徐 曉 萌 等［9］研 究 發(fā) 現(xiàn)，5-LOX/COX-2 雙重抑制劑Darbufelon 對胃癌SGC-7901 裸鼠移植瘤的生長有明顯的抑制作用，說明單一的5-LOX 通路和單一的COX-2 通路在促進腫瘤演進方面可能作用點并不一樣，聯(lián)合抑制兩條通路可能作用更佳，這與研究結果相符。本實驗結果顯示，5-LOX 在胃癌組織中高表達，但在患者的不同年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤病理類型組比較，差異無統(tǒng)計學意義，而其陽性率與患者臨床分期、淋巴結轉移密切相關，說明5-LOX 主要參與了胃癌的侵襲、轉移過程。盛燁華［10］研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX mRNA表達陽性率及相對表達量與胃癌的分化程度有關，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX 的表達與胃癌的分化程度并不相關，可能與檢測方法不同有關（分別采用的RT-PCR法檢測mRNA和免疫組化法檢測蛋白）。

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是細胞內的重要酶類，是AA 代謝生成產物的限速酶。COX 主要有三種亞型：COX-1、COX-2及COX-3（COX-1的剪接體）。COX-1 及COX-3 在此不贅述。COX-2 屬于誘導酶，即只在病理狀態(tài)下產生，主要在炎癥和腫瘤部位，在細胞因子及生長因子的誘導下表達［11］，因此它對調控炎癥及腫瘤微環(huán)境非常重要［12］。研究表明，COX-2 在包括結腸癌、胰腺癌在內的多種惡性腫瘤中均高表達［5］。臨床研究方面，COX-2 抑制劑能預防治療結腸腫瘤［13］。COX-2 在功能上具有環(huán)氧化和過氧化酶的作用。它能夠引起多種前致癌物激活，通過癌基因的激活和抑癌基因的突變引起腫瘤發(fā)生。COX-2 的過表達進而引起PGE2 的生成增加，而PGE2 具有促進凋亡、抑制增殖并且促進血管形成的作用［14］。有研究表明，COX2 可以通過上調MMP-2 的表達促進腫瘤侵襲，提示MMP-2 可能是COX-2 的下游分子，參與胃癌的侵襲與轉移。本實驗結果顯示，在胃癌組織及細胞中，COX-2 的表達與5-LOX 表達不相關，提示COX-2 和5-LOX可能為兩條彼此獨立的信號通路，但作用均是促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。Liu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，毛柳甙通過重塑巨噬細胞內COX-2，5-LOX 和P450 介導的花生四烯酸代謝可以減輕痛風性關節(jié)炎的癥狀。

LX是體內AA經脂氧合酶代謝途徑產生的內源性脂類物質，最常見的亞型是LXA4和LXB4，它們具有很強的抗炎和促進炎癥消退的作用，促進炎癥及時消退，而慢性炎癥與很多腫瘤的發(fā)生密切相關。LX 主要是通過與FPR2 結合而發(fā)揮作用，F(xiàn)PR2 是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，具有7次跨膜結構，屬于甲酰肽受體（FPR）的第二個成員，此外FPR2也可歸于前列腺素類受體，屬于化學引誘劑受體家族。LX與FPR2 結合后可以通過細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）途徑、p38 途徑及Jun 氨基末端激酶（JNK）途徑等發(fā)揮抗炎作用。趙志輝等［16］的研究表明FPR2在正常大腸組織、大腸腺瘤組織及大腸癌組織中表達逐漸降低，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義。王教學等［17］研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中的結果與腸癌并不相同，他們研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PR2是影響胃癌患者預后的獨立因素，F(xiàn)PR2 陽性的患者的生存時間短于FPR2 陰性的患者，這說明，F(xiàn)PR2可能具有組織特異性，與胃癌的進展密切相關。而李遠美等［18］則通過細胞實驗和動物實驗證實，F(xiàn)PR2促進胃癌細胞侵襲及轉移。本實驗研究結果表明，雖然FPR2 在胃癌中的表達率也較高，但與5-LOX 的表達表達并不相關，提示可能二者在胃癌的發(fā)生發(fā)展中涉及不同的信號通路。

為了驗證臨床標本的結果，在細胞實驗中，采用沉默5-LOX 基因的方法，觀察對COX-2 及FPR2 mRNA 表達是否有作用。結果顯示COX-2 及FPR2 mRNA 表達并無變化，與臨床標本免疫組化檢測結果相符。

本研究結果顯示5-LOX、COX2 與FPR2 三者雖然在LX 生成及抗腫瘤過程中都發(fā)揮著重要作用，但在胃癌組織表達卻不存在相關性，表明這三種蛋白各自有其特有的誘導表達機制及發(fā)揮效應機制。Chang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，降低5-LOX 及COX-2 的表達抑制結腸癌的演進，其通路是通過促進PTEN 并抑制PI3K/AKT 通路。而 且5-LOX 及COX-2 為AA 的兩條主要代謝通路，二者雖然不存在相關性，但兩個酶有如此相近作用原理和酶底物，也極有可能出現(xiàn)一個酶途徑被阻斷而激活另一酶途徑，提示在治療胃癌時采用兩個代謝途徑的共同抑制較僅用一種基因抑制效果更好，同時針對這兩種酶的抑制劑有望成為治療胃癌的新策略。