頭頂一顆珠提取液對實驗性糖尿病大鼠心肌損傷的干預作用*

王鳳杰，王科坤，陳顯兵，劉錦紅，高　嵩，劉　昕

(1.湖北民族學院科技學院，恩施 445000；2.恩施州疾控中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學院醫(yī)學院，恩施 445000；4.附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

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頭頂一顆珠提取液對實驗性糖尿病大鼠心肌損傷的干預作用*

王鳳杰1,3，王科坤2△，陳顯兵3，劉錦紅4，高嵩4，劉昕4

(1.湖北民族學院科技學院，恩施 445000；2.恩施州疾控中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學院醫(yī)學院，恩施 445000；4.附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

目的：探討頭頂一顆珠提取液(TTM)對糖尿病大鼠心肌損傷的干預作用及機制，為進一步研究頭頂一顆珠的藥理作用提供理論基礎。方法：雄性SPF級SD大鼠48只，隨機分為4組(n=12)正常對照組、模型組、干預組、及陽性對照組，采用高脂飲食加一次性尾靜脈注射STZ 35 mg/kg復制糖尿病模型。干預組在實驗開始時給予TTM 濃度1 mg/ml頭頂一顆珠提取液3 ml灌胃，每天1次；造模成功后陽性對照組用二甲雙胍5mg/kg.d灌胃治療，各組繼續(xù)喂養(yǎng)6周，處死大鼠，取血測B型腦鈉肽(BNP)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平，心臟稱重計算心臟重量指數(shù)(心重/體重)，TUNEL法計算心肌細胞凋亡指數(shù)，取心室肌組織行常規(guī)形態(tài)學及Masson染色觀察，檢測心肌組織SOD,GPx，MDA水平。結果：TTM干預可明顯降低糖尿病大鼠心臟重量，降低血清中BNP、cTnI水平，提高心肌組織中SOD,GPx活性，降低MDA含量，抑制心肌細胞凋亡，而且在增強GPx活性、抑制膠原纖維產生方面，TTM作用比西藥二甲雙胍效果更好。結論：頭頂一顆珠提取物可能通過減輕糖尿病大鼠體內氧化應激反應，進而抑制心肌細胞凋亡，減少膠原纖維產生，來達到保護心肌細胞損傷的作用。

頭頂一顆珠；糖尿病大鼠；心肌損傷；氧化應激

頭頂一顆珠(trillium tschonoskii maxim,TTM)系百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖(俗稱地珠)，是湖北恩施土家族地區(qū)的珍稀藥材，被奉為“神藥”，主要含有甾體皂甙、黃酮苷及倍半萜苷等有效成分[1]，具有抗癌、抗炎、提高免疫力、改善心功能和降壓、降脂、清除自由基、抗衰老等功效[2,3]。關于頭頂一顆珠提取物對糖尿病的作用研究很少，本課題組前期研究 發(fā)現(xiàn)頭頂一顆珠提取液灌胃處理后，糖尿病大鼠一般情況、血糖、血脂等指標得到明顯改善[4，5]，本研究進一步探討其對糖尿病大鼠心肌損傷的干預機制，為TTM的臨床應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1動物、藥品與試劑

實驗動物：SD大鼠，雄性，SPF級，體重150～180 g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。

藥品與試劑：頭頂一顆珠根狀莖及根購于湖北省樂之塬科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購于美國 Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；BNP、cTnI檢測試劑盒購于上海邦奕生物科技有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購于瑞士羅氏公司。

1.2頭頂一顆珠提取液制備

取頭頂一顆珠根狀莖及根烘干粉碎，過60目篩，用石油醚浸泡3 h后，加熱回流提取2 h，過濾，濾渣為脫脂粗粉；用75%乙醇浸泡數(shù)小時后回流提取，反復多次，將提取液濾過并減壓濃縮、干燥，得總提取物；加水至總提取物全部溶解，用適量乙醚反復萃取多次，除去濃縮液中的脂溶性成分；脫脂后水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮干燥，得延齡草總皂苷，經測定藥品總皂苷含量(18.54 mg/g生藥材)；超純水配成1 mg/ml溶液備用。

1.3糖尿病模型及分組

雄性SPF級SD大鼠48只，隨機分為正常對照組(N，)、模型組(DM)、頭頂一顆珠提取液干預組(TTM)、及二甲雙胍(Metformin)治療(Met)作為陽性對照組，每組12只，除正常對照組外，其他各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)。干預組在實驗開始時給予TTM 濃度1 mg/ml提取液3 ml灌胃，每天1次；正常組和模型組給予同體積飲用水灌胃。喂養(yǎng)4周后給予一次性尾靜脈注射STZ 35 mg/kg，5 d后測空腹血糖，連續(xù)2次血糖>13.9 mmol/L，且有多飲、多食、多尿的大鼠為造模成功，用于后期實驗，此時各組大鼠例數(shù)分別為N(n=12)，DM(n=10)，TTM(n=12)，Met(n=11)。二甲雙胍治療組在造模成功后用5 mg/(kg·d)灌胃，每天1次，治療6周；其余組繼續(xù)灌胃喂養(yǎng)6周后，處死大鼠行各項指標檢測。

1.4血液生化指標檢測

實驗結束后立即處死取血，檢測血清中BNP、cTnI水平，完整取出心臟，剪除包膜、大血管等，稱重；計算心重指數(shù)。心臟體重指數(shù)(CWI)= 心臟重量(mg)/大鼠體重(g)。

1.5心肌組織SOD、GPX、MDA檢測

取適量左心室肌組織，在1～4℃條件下制成100 g/L心肌組織生理鹽水勻漿液，按試劑盒方法測定SOD、GPX、MDA。其中SOD采用黃嘌呤氧化酶法，MDA采用TBA法，GPx采用比色法測定。另取部分心室肌組織用10%多聚甲醛固定備用。

1.6Masson染色檢測心肌組織膠原容積分數(shù)

另取部分心室肌組織用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋后制成4 μm切片，脫蠟后蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化，洗滌后用麗春紅酸性品紅溶液染色5 min，迅速水洗后再1%磷鉬酸中染色3 min，又在甲苯胺藍中染5 min后水洗烘干，樹膠封片后觀察。采用顯微鏡對所得切片觀察并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行圖片分析，計算膠原纖維染色面積占觀察視野面積的分數(shù)，即為膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)[6]。

1.7心肌細胞凋亡指數(shù)檢測

采用TUNEL法：4%甲醛固定心肌組織，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，每只大鼠制作10張切片，常規(guī)HE染色。按TUNEL試劑盒說明進行操作，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算凋亡指數(shù)。每個標本隨機選取10個高倍視野(×400)，分別計數(shù)凋亡細胞核和正常細胞核，以凋亡細胞核與正常細胞核比值的平均值作為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)[7]。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1各組大鼠一般情況觀察

正常對照大鼠活潑健壯，皮毛有光澤，對外界反應靈敏，體重穩(wěn)步增長；模型組注射STZ后第四天出現(xiàn)多汗、皮毛無光澤；隨后多飲多尿、體重下降、尿液腥臊味重；干預組及陽性對照組自第二周后一般情況有所改善，皮毛光澤度漸好，多飲多食多尿情況好轉，體重緩慢增加，兩組大鼠一般情況無明顯差別。

2.2心重指數(shù)及血清中BNP、cTnI含量情況

與正常對照組相比，糖尿病模型組大鼠血清中BNP 、cTnI水平明顯升高，TTM干預后可降低血清cTnI含量(P<0.05)；TTM組及Met組大鼠血清BNP水平較DM組明顯降低，但仍然高于正常組。TTM可以減輕糖尿病所致大鼠心臟重量的增加(P<0.05)，Met作用更明顯(P<0.01,表1)，但TTM組和Met組無明顯差別(P>0.05)。

2.3TTM對大鼠心肌組織SOD、GPX、MDA的影響

從表2中可看出，糖尿病模型組大鼠心肌SOD、GPX活性顯著低于正常組，MDA高于正常組，提示大鼠心肌存在明顯氧化應激反應；TTM干預后心肌組織SOD和GPX活性明顯增高，MDA水平降低(P<0.05)；而Met組治療后SOD活性顯著增高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，GPX活性無明顯升高(P>0.05)，但TTM組和Met組無差別。

GroupnBNP(ng/L)cTnI(μɡ/L)CWI(mg/g)N12101.03±9.210.31±0.062.75±0.59DM10385.12±10.52*0.74±0.02*3.24±0.35*TTM12201.67±11.30*#0.45±0.01#2.97±0.61#Met11189.54±9.24*#0.52±0.05*#2.82±0.26##

BNP:Brain natriuretic peptide;cTnI:Cardiac troponin I;CWI:Cardiac weight index;N:Normal group;DM:Diabetes mellitus group;TTM:Trillium tschonoskii maxim group;Met:Metformin group

*P<0.05 vs N;#P<0.05，##P<0.01 vs DM

GroupnSOD(U/mg·pro)MDA(nmol/mg·pro)GPX(U/mg·pro)N1282.02±11.203.02±1.0258.21±10.23DM1052.12±9.68*3.98±0.95*41.02±9.85*TTM1278.12±9.36#3.36±1.13#55.24±8.76#Met1176.06±8.45#3.42±1.02#45.14±8.72

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;GPX:Glutathione peroxidase

*P<0.05 vs N;#P<0.05 vs DM

2.4各組大鼠心肌組織形態(tài)學觀察

常規(guī)形態(tài)學觀察可看出：正常組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，走向好，橫紋清晰，細胞間隙均勻，可見少量纖維組織；模型組心肌細胞排列紊亂，散在肌纖維變性、胞漿粗顆粒狀，間質水腫、淋巴細胞浸潤、纖維組織增生明顯，部分肌纖維被大量條狀、束狀膠原纖維代替；TTM干預及Met組心肌纖維排列較模型組規(guī)則，細胞變性較輕，膠原纖維明顯減少(圖1見彩圖頁Ⅰ)。

2.5心肌組織Masson染色及細胞凋亡指數(shù)檢測

Masson 染色中膠原纖維呈藍色，正常心肌細胞呈紅色。用圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)所占觀察視野的面積比，結果見表3。與HE染色結果一致，正常對照組心肌細胞排列整齊、致密，細胞間少有膠原纖維；模型組心肌細胞排列松散，心肌間質內及小血管旁可見較多膠原纖維分布，部分呈片狀堆積；由統(tǒng)計結果可見TTM干預后膠原纖維量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；二甲雙胍治療組心肌間質內膠原纖維含量沒有明顯減少(P>0.05)。

與正常組相比，糖尿病模型組大鼠心肌凋亡指數(shù)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，TTM組和Met組心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)；但是TTM干預和Met治療均不能降低細胞凋亡至正常水平(表3)。

Tab.

CVF：Collagen volume fraction；AI：Apoptosis index

*P<0.05，**P<0.01 vs N;#P<0.05 vs DM

3　討論

隨著生活水平的提高及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并發(fā)癥，主要病理改變?yōu)樾募〖毎饣|(extracellular matrix,ECM)堆積，心肌肥厚及心肌間質纖維化等，其中間質纖維化是糖尿病心肌病的重要特征，姜黃素衍生物可通過改善糖尿病大鼠糖脂代謝并減輕心肌纖維化來達到保護心肌的作用[8]。目前關于糖尿病心肌病的發(fā)生機制尚不清楚，2004年美國糖尿病學會(ADA)年會上Brownlee教授提出了糖尿病并發(fā)癥氧化應激共同通路機制的學說：高糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，發(fā)生氧化應激，近年來多項研究結果表明抗氧化治療可抑制糖尿病心肌損傷[9,10]。本研究證實糖尿病大鼠血清中cTnI、BNP明顯增高，證明心肌細胞損傷明顯；TTM干預后cTnI、BNP水平均降低，表明TTM對保護糖尿病大鼠心肌損傷、改善心功能有一定作用，因此我們試圖從氧化應激方面研究頭頂一顆珠對糖尿病心肌損傷的干預作用機制。

在體內高糖環(huán)境下，葡萄糖對線粒體的持續(xù)氧化可導致體內活性氧(ROS)的大量產生，氧化-還原平衡破壞，進而激活基質金屬蛋白酶類，后者在心肌纖維化、心臟重塑等病理變化中扮演重要的角色[11]。實驗證明，在1型和2型糖尿病心臟中均存在線粒體ROS的高表達[12]；也有學者提出減少心肌ROS的產生或加強抗氧化能力有望減輕DCM的心臟功能失常[13]。張偉[14]等研究也發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素干預后大鼠的心肌間質中膠原沉積得到明顯改善，膠原容量分數(shù)顯著下降，提示脂聯(lián)素治療能夠達到延緩糖尿病心肌病心肌纖維化的目標。我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌細胞肥大、膠原纖維增生，另可見小血管內膜增厚等，TTM干預后可減少間質膠原纖維產生，可能是因為頭頂一顆珠提取物有效成分內含多種皂苷，降低糖尿病大鼠心肌脂質過氧化物(MDA)的產生，提高其抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、GPx)的活力，通過抑制氧化應激而延緩心肌纖維化來發(fā)揮心肌損傷保護作用，但是二甲雙胍無此作用；另外也可能是其提取物中含有較高微量元素硒，硒也已證實具有抗氧化作用。因此TTM提取物對于緩解糖尿病患者體內氧化應激及重要器官損傷(如心臟)所致的并發(fā)癥有積極作用。

有報道[15,16]證實糖尿病氧化應激與心肌細胞凋亡密切相關，氧化應激可促進心肌細胞凋亡；糖尿病心肌病變發(fā)生與心肌細胞凋亡有關[5]，韋金儒[17]等研究證實頡沙坦可抑制心肌組織中3-硝基酪氨酸誘導的心肌細胞凋亡，但對心臟擴大無明顯改善，且氧化應激是凋亡、細胞壞死和纖維化的重要途徑。人參皂苷Rg1可抑制高糖所致的心肌細胞肥大[18]，可通過減少心肌細胞凋亡和抗氧化作用保護糖尿病大鼠心肌損傷[19]，我們也發(fā)現(xiàn)頭頂一顆珠提取物可以明顯減少心肌細胞凋亡，可能是其內皂苷成分通過抑制機體氧化應激而發(fā)揮抗細胞凋亡作用，但其作用途徑還有待研究。

總之，氧化應激性損傷與糖尿病心肌病變的發(fā)生密切相關；鑒于臨床常用藥物的副作用大等特點，而中藥頭頂一顆珠已證實具有抗炎、抗氧化和降脂等作用，因此開發(fā)中藥產品及用中藥干預調理等有可能成為臨床用藥的參考。本研究證實頭頂一顆珠可明顯增強心肌內抗氧化酶活性及減輕脂質過氧化，抑制心肌細胞凋亡，減少膠原纖維沉積，從而預防或延緩心肌病變的發(fā)生，因此推測其具有抗氧化和抗細胞凋亡作用，而且通過中藥干預機體氧化應激可能成為糖尿病心血管病變治療的新方法。

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Intervention effect of trillium tschonoskii maxim extract solution on myocardial injury in diabetic rats

WANG Feng-jie1,3,WANG Ke-kun2△,CHEN Xian-bing3,LIU Jin-hong4,GAO Song4，LIU Xin4

(1.Science and Technology College of Hubei Minzu University,Enshi 445000;2.Enshi Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000; 3.Medical School of Hubei Minzu University,Enshi 445000;4.Pathology Department in Affiliated Hospital of Hubei Minzu University,Enshi 445000,China)

Objective:To study the protective effect and the underlying mechanism of trillium tschonoskii maxim(TTM,Traditional Chinese Medicine)on myocardial injury of diabetic rats induced by high-fat diet and streptozotocin(STZ),which will lay a theoretical foundation for further exploring its pharmacological effect.Methods:SD male rats received high fat diet and STZ(35 mg/kg)via tail vein injection were modeled into diabetic rats,the levels of brain natriuretic peptide(BNP)and cardiac troponin I(cTnI)in serum ,the contents of superoxide(SOD),glutathione peroxidase(GPX)，malondialdehyde(MDA)in cardiac tissues，and cardiac myocyte apoptosis index were tested in all groups after the last administration.Results:Compared with that in the model group,SOD and GPX activities were significantly increased and levels of BNP、cTnI、cardiac weight index(CWI)、apoptosis index(AI)were decreased in TTM and metformin(Met)group.The effects of TTM were better than traditional medicine metformin in enhancing GPX activity and decreasing collagen level.Conclusion:TTM can inhibit myocardial apoptosis by reducing oxidative stress responses in diabetic rats,which can slow down collagen fiber production to protect the myocardial cell injury.

TTM(Traditional Chinese Medicine);myocardial injury;diabetic rats;oxidative stress

湖北省教育廳科學技術研究項目(B2015112)

2015-09-14

2016-01-22

△Tel：15571851801；E-mail：625958220@qq.com

R587.1

A

1000-6834(2016)02-177-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.022