一個(gè)家兔生理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與方法改進(jìn)

劉瑩瑩，宋 萃，趙麗華，于珊珊△

(1山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院動(dòng)物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室， 威海 246209； 2山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室; 3山東大學(xué)(威海) 海洋學(xué)院微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室； △通訊作者)

動(dòng)物生理學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的基礎(chǔ)學(xué)科，而動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)在理論教學(xué)中發(fā)揮著重要作用[1]。實(shí)驗(yàn)課程不僅能強(qiáng)化對(duì)概念、理論的理解，更能使學(xué)生充分認(rèn)識(shí)實(shí)驗(yàn)在科學(xué)理論產(chǎn)生和發(fā)展中的作用，同時(shí)也是培養(yǎng)學(xué)生從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表觀現(xiàn)象探尋事物的內(nèi)在聯(lián)系和發(fā)展規(guī)律、培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維能力、提高學(xué)生創(chuàng)新能力的重要途徑。撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告則使學(xué)生學(xué)會(huì)用邏輯性語(yǔ)言表達(dá)研究結(jié)果，為今后獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究打下良好的基礎(chǔ)[2]。

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)一般采用先理論后實(shí)踐的方式進(jìn)行，側(cè)重對(duì)課堂理論知識(shí)的驗(yàn)證與鞏固，過(guò)分強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)課是作為理論知識(shí)的驗(yàn)證手段功能，容易造成學(xué)生重理論、輕實(shí)驗(yàn)的心理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生經(jīng)常按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)機(jī)械操作，不動(dòng)腦思考，不利于知識(shí)結(jié)構(gòu)的形成和思維的拓展[3]。另一方面，傳統(tǒng)動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，各器官系統(tǒng)活動(dòng)調(diào)節(jié)單獨(dú)進(jìn)行，一般一只動(dòng)物只進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，這就加大了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料需求量，經(jīng)常造成資源浪費(fèi)[4]；而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本也逐年增高，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的綜合利用變得非常重要[5-7]。為了使學(xué)生系統(tǒng)性掌握動(dòng)物生理學(xué)課程基本理論，本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行動(dòng)物生理學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年教學(xué)科研實(shí)踐過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，提出本課題的研究。課題設(shè)計(jì)包括家兔動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)、呼吸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和影響尿生成因素的觀察三個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合。該實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，使得三個(gè)實(shí)驗(yàn)利用一只兔子同時(shí)進(jìn)行且順利完成，并取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。本課題的設(shè)計(jì)極大提高了學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)分析問(wèn)題的能力，有利于培養(yǎng)學(xué)生的科研創(chuàng)新思維，為我校建設(shè)研究型大學(xué)本科人才培養(yǎng)體系貢獻(xiàn)力量。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年雄性家兔。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械

實(shí)驗(yàn)器械包括常用手術(shù)器械、恒溫兔臺(tái)、成都泰盟BL-420N生物信息采集與分析系統(tǒng)、刺激電極、保護(hù)電極、張力傳感器、壓力傳感器、氣管插管、蛙心夾、動(dòng)脈夾、止血鉗、玻璃分針、絲線、注射器、橡皮管等。

1.3 藥品

藥品包括臺(tái)式液、麻醉劑，例如20%氨基甲酸乙酯、腎上腺素、乙酰膽堿、阿托品、NaOH、HCl、CaCl2、乳酸等。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟和方法

1.4.1 動(dòng)物麻醉與固定 實(shí)驗(yàn)人員用20%氨基甲酸乙酯按照5 ml/kg體重劑量從耳緣靜脈注射麻醉劑，麻醉動(dòng)物后將其背位固定于手術(shù)臺(tái)上，打開(kāi)手術(shù)臺(tái)保溫功能進(jìn)行保溫，剪去頸部被毛，可進(jìn)行手術(shù)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作 實(shí)驗(yàn)人員沿頸部正中切開(kāi)皮膚，依次分離出氣管、兩側(cè)頸總動(dòng)脈、交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)；進(jìn)行尿道插管術(shù)，將使用甘油作為潤(rùn)滑劑浸潤(rùn)的導(dǎo)尿管從家兔尿道口輕輕插入10 cm左右導(dǎo)尿，有尿液流出表明插管成功；在等待尿流量穩(wěn)定的過(guò)程中，進(jìn)行氣管插管術(shù)、動(dòng)脈插管術(shù)；在分離出的氣管近喉頭2 cm處作一“T”形切口，將于氣管口徑相近的氣管插管向心方向插入氣管中并用線結(jié)扎固定，并在分離出的迷走神經(jīng)下穿線備用；將左側(cè)頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾??；在緊靠結(jié)扎處的斜后方在動(dòng)脈上沿向心方向做一斜行切口，將準(zhǔn)備好的已注滿肝素生理鹽水的動(dòng)脈套管由切口插入動(dòng)脈管內(nèi)，用線將動(dòng)脈套管尖端固定于動(dòng)脈管內(nèi)，并將余線結(jié)扎于套管的側(cè)管上，以防滑脫。

1.4.3 連接實(shí)驗(yàn)裝置 動(dòng)脈套管固定好后，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)壓力傳感器將其連接到生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的壓力通道；用蛙心夾夾住家兔腹部起伏最大的皮膚處，連接張力傳感器后接入生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的輸入端進(jìn)行記錄。刺激電極與保護(hù)電極根據(jù)需要與系統(tǒng)的刺激輸出端連接。實(shí)驗(yàn)人員啟動(dòng)生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 觀察項(xiàng)目 ①實(shí)驗(yàn)人員記錄正常呼吸運(yùn)動(dòng)，依次用通入CO2、夾閉氣管插管、增大無(wú)效腔，觀察各因素對(duì)呼吸運(yùn)動(dòng)的影響。②實(shí)驗(yàn)人員記錄正常血壓曲線，觀察夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈、CO2升高對(duì)血壓的影響。③實(shí)驗(yàn)人員同步記錄麻醉狀態(tài)下的正常尿量。④實(shí)驗(yàn)人員觀察耳緣靜脈注射各種藥物對(duì)呼吸、血壓和泌尿的影響。⑤實(shí)驗(yàn)人員刺激各神經(jīng)，觀察對(duì)呼吸、血壓和泌尿的影響。⑥實(shí)驗(yàn)人員剪斷各神經(jīng)，觀察對(duì)對(duì)呼吸、血壓和泌尿的影響。

2 綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)及效果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉處理及方法的改進(jìn)

由于兔子耳緣靜脈血管較細(xì)，且耳緣靜脈注射藥劑種類較多，反復(fù)穿刺注射容易導(dǎo)致其后注射的失敗。鑒于此，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用留置針穿刺后將其固定于耳緣，以備多次注射藥劑使用。留置針使用的針頭較軟、較細(xì)，柔韌性較好，因此能夠較好地保護(hù)兔子耳緣靜脈血管，并可進(jìn)行多次不同藥劑的更換注射。該方法較大程度地緩解了家兔多次穿刺注射造成的血管損傷，減少學(xué)生多次穿刺注射的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。

2.2 呼吸運(yùn)動(dòng)的描記手術(shù)方法改進(jìn)

呼吸運(yùn)動(dòng)以往的實(shí)驗(yàn)需要切開(kāi)皮膚暴露胃，該手術(shù)過(guò)程容易造成較大創(chuàng)傷。綜合實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)行，容易造成時(shí)間耽擱、動(dòng)物損失。我們經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐過(guò)程，改進(jìn)了方法，無(wú)需進(jìn)行手術(shù)切開(kāi)皮膚，直接將蛙心夾夾住腹部皮膚起伏最大處，連線連到張力傳感器上即可進(jìn)行記錄。該方法無(wú)手術(shù)，減輕了學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性，在空間及時(shí)間上都極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率，避免了手術(shù)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)帶來(lái)的影響綜合實(shí)驗(yàn)效果的弊端。在多年的實(shí)踐過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，該方法記錄結(jié)果與夾住胃壁實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，能很好地完成呼吸運(yùn)動(dòng)的描記。

2.3 尿液收集方法的改進(jìn)

該綜合實(shí)驗(yàn)中涉及影響尿生成因素手術(shù)中導(dǎo)尿方法操作。以前的實(shí)驗(yàn)常用膀胱插管法和輸尿管插管法兩種方法[8]。這兩種方法需要進(jìn)行開(kāi)腹手術(shù)，手術(shù)步驟多，操作復(fù)雜，且手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)。但是在實(shí)際手術(shù)后，教師又經(jīng)常發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)漏尿、無(wú)尿等插管失敗現(xiàn)象。這一方面可能是由于手術(shù)造成的創(chuàng)傷，影響了家兔的機(jī)能狀態(tài)，從而引起損傷性避尿，另一方面，開(kāi)腹后容易造成腹腔溫度變低引起的內(nèi)臟器官血管收縮現(xiàn)象，該現(xiàn)象也會(huì)減少尿的生成。因此，我們?cè)趯?shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中改進(jìn)方法，使用2 kg以上雄性家兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將膀胱/輸尿管插管改為尿道插管導(dǎo)尿，減少手術(shù)創(chuàng)傷面。實(shí)驗(yàn)效率和成功率都得到了極大的提高，也能較好地保證綜合實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

3 討論

動(dòng)脈血壓的測(cè)定及影響因素的觀察、呼吸運(yùn)動(dòng)生理及其影響因素觀察、尿生成的調(diào)節(jié)都是動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常重要而且又有一定難度的經(jīng)典基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，有很強(qiáng)的理論和實(shí)踐性。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中這三個(gè)實(shí)驗(yàn)需要三只家兔[9]。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，將三個(gè)實(shí)驗(yàn)合理整合，有助于學(xué)生從器官水平及整體水平把握動(dòng)物生理現(xiàn)象，更好地找到生命現(xiàn)象的內(nèi)部聯(lián)系。在綜合實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行過(guò)程中，我們不僅獲得了3個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)效果，而且通過(guò)改進(jìn)藥物注射、呼吸運(yùn)動(dòng)的描記以及尿液收集的方法，一方面使家兔得到了充分利用，有效節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，另一方面，減少手術(shù)步驟，極大提高了實(shí)驗(yàn)效率，更為重要的是加強(qiáng)了學(xué)生對(duì)于生命與整體觀的理解。在有限的時(shí)間內(nèi)同步進(jìn)行3個(gè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)學(xué)生的配合能力要求較高，不僅需要將理論知識(shí)前后融會(huì)貫通，而且需要較好的應(yīng)變能力。綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)訓(xùn)練使得實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在縱深度與寬廣度上得到更大的擴(kuò)展，鍛煉了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技巧，培養(yǎng)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力、知識(shí)的綜合運(yùn)用能力和創(chuàng)新科研能力。同時(shí)，綜合實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行也拓展了教師的思路。在探討和解決實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的過(guò)程中，教師的綜合教學(xué)科研能力也得到了提高。

總之，該綜合實(shí)驗(yàn)仍需要我們?cè)趯?shí)踐中不斷完善，繼續(xù)改進(jìn)和合理化其操作流程，使整個(gè)過(guò)程更加規(guī)范、科學(xué)和系統(tǒng)化，以利于高校、實(shí)驗(yàn)室的開(kāi)展和實(shí)踐。