光譜法研究赤蘚紅和溶菌酶的相互作用

張彥青，劉娜，張麗，付鳳艷，張彥，陳靈智，王曉紅

(衡水學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000)

赤蘚紅(erythrosine，簡(jiǎn)稱(chēng)ETS)是一種人工合成色素，因外觀(guān)鮮艷、人工成本低、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，故常被用于食品及調(diào)味品的加工與生產(chǎn)，以提高其感官性。但有數(shù)據(jù)表明，赤蘚紅色素被大量攝入人體后會(huì)危害人體健康[1-2]，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定，人均日允許攝取量不能超過(guò)1.25 mg/kg[3]。溶菌酶(lysozyme，簡(jiǎn)稱(chēng)LYSO)是一種堿性蛋白，由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含6個(gè)色氨酸(Trp)殘基和3個(gè)酪氨酸(Tyr)殘基。而食用色素赤蘚紅經(jīng)食用后，會(huì)與人體中蛋白質(zhì)結(jié)合，將影響LYSO的結(jié)構(gòu)和性能。近年來(lái)，趙剛等[4]研究了赤蘚紅與牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制及金屬離子Cu2+和Zn2+對(duì)其的影響。湯小玉等[5]利用同步熒光光譜法對(duì)日落黃與人血清蛋白的相互作用機(jī)制進(jìn)行了研究。王新等[6]采用熒光發(fā)射光譜與紫外-可見(jiàn)分光光度法等多重光譜技術(shù)在模擬條件下研究燦爛甲酚藍(lán)與人血清白蛋白的結(jié)合對(duì)構(gòu)象的影響。本文通過(guò)光譜法和分子對(duì)接技術(shù)研究了ETS與 LYSO之間的作用機(jī)制，獲得了結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，為食用合成色素在食品和調(diào)味品科學(xué)方面的應(yīng)用提供了一些有價(jià)值的信息。因此，研究色素對(duì)生物大分子的作用機(jī)制，從分子水平上闡明其效應(yīng)，有助于評(píng)價(jià)人工合成色素在食品及調(diào)味品行業(yè)的安全性[7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

F-7000熒光儀 日本日立公司；HWSY11-K恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；SZ-93純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.2 試劑

LYSO濃度配成2.0×10-5mol/L的溶液，純度≥99%；ETS濃度配成1.0×10-4mol/L的溶液；為維持生理?xiàng)l件下的離子強(qiáng)度，在pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液中添加濃度0.15 mol/L 的NaCl溶液；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。儲(chǔ)備液的保存條件：277 K，避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光猝滅法

在一定溫度(294，304，308 K)下向10.0 mL比色管中按順序加入1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L LYSO溶液和不同體積的濃度為1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容，搖勻并恒溫30 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，掃描ETS-LYSO體系的熒光光譜圖。

1.3.2 三維熒光光譜法

在294 K溫度下，取10 mL的比色管2支，均加入1.0 mL 2.0×10-5mol/L的LYSO溶液，加入1.0 mL pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液，向2支比色管中分別加入0，1.0 mL 1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容，2支比色管同時(shí)置于294 K溫度梯度下30 min，掃描三維熒光光譜。

1.3.3 分子對(duì)接

通過(guò)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，溶菌酶PDB代碼為132L，對(duì)溶菌酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，刪除多余的水分子并進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化，作為分子對(duì)接的受體。獲取化合物ETS的分子結(jié)構(gòu)，加氫處理，并采用MOPAC程序[8]優(yōu)化結(jié)構(gòu)，計(jì)算PM3原子電荷。最后，采用AutoDock Tools 1.5.6[9]分別處理ETS和LYSO的結(jié)構(gòu)，然后對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)利用AutoDock 4.2.6軟件處理，得到作用體系的最佳結(jié)合構(gòu)象[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ETS-LYSO體系的熒光猝滅光譜

激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，固定LYSO的濃度，改變ETS的濃度，ETS與LYSO作用的熒光光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 ETS-LYSO的熒光發(fā)射光譜(T=294 K)Fig.1 The fluorescence emission spectra of ETS-LYSO system (T=294 K)

由圖1可知，隨著ETS濃度的增加，LYSO在343 nm處呈現(xiàn)有規(guī)律的降低，可見(jiàn)ETS對(duì)LYSO有熒光猝滅的作用并生成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

通過(guò)Stern-Volmer[11]方程，猝滅常數(shù)Ksv、猝滅速率常數(shù)Kq與溫度的相關(guān)性判斷作用機(jī)制：

F0/F=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]。

(1)

式中：F0、F分別為未加入ETS前和加入ETS后測(cè)出的熒光強(qiáng)度；τ0為分子熒光平均壽命,約為10-8s；[L]為加入ETS的濃度。根據(jù)[L]與F0/F的數(shù)據(jù)分別為橫、縱坐標(biāo)作圖得到3個(gè)溫度下的3條直線(xiàn)，直線(xiàn)斜率為Ksv，得到數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下ETS-LYSO體系的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 The quenching reactive parameters of ETS-LYSO system at different temperatures

由表1可知，3個(gè)溫度下的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r1均大于0.99，說(shuō)明3個(gè)溫度下的直線(xiàn)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，即ETS-LYSO體系相互作用是單一猝滅；3個(gè)溫度下的Kq值均大于2×1010L/(mol·s)(最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù))，并且ETS-LYSO體系的Kq和Ksv值均隨著溫度的升高而降低，因此可確定ETS與LYSO體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅[12]。

用靜態(tài)猝滅公式lg[(F0-F)/F]=n·lg[L]+lgKa(2)，處理計(jì)算ETS與LYSO體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由表1可得n值約為1，說(shuō)明ETS在與LYSO結(jié)合時(shí)只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[13]，即ETS-LYSO體系形成了1∶1的復(fù)合物；Ka值隨著溫度的上升而趨向減小，即該體系的結(jié)合能力降低，且都在104數(shù)量級(jí)，即該體系的結(jié)合能力降低，再一次說(shuō)明ETS與LYSO相互作用方式為靜態(tài)猝滅。

2.2 ETS-LYSO 體系的作用力類(lèi)型

根據(jù)Van't Hoff方程，公式RlnK=ΔS-ΔH/T(3)，ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS(4)，通過(guò)計(jì)算得到ETS與LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溫度下ETS-LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù)

由表2可知，ΔG<0表明該體系的作用是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH<0表明體系復(fù)合物的形成過(guò)程是放熱反應(yīng)，作用過(guò)程存在氫鍵[14]；色素分子與蛋白分子之間存在疏水作用力的論據(jù)[15]是ΔS>0，由此推斷ETS與LYSO之間作用有氫鍵和疏水作用力存在。

有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)ΔH<0、ΔS>0時(shí)，認(rèn)為體系間主要作用力類(lèi)型為靜電作用力[16],因此試驗(yàn)了離子強(qiáng)度因素對(duì)體系相互作用的影響。即ETS和LYSO的濃度為定值，改變NaCl的濃度，以NaCl的濃度CNaCl、F/F0為橫、縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖2。

圖2 ETS-LYSO體系熒光強(qiáng)度隨NaCl濃度的變化(T=294 K)Fig.2 The changes in fluorescence intensity of ETS-LYSO system with NaCl concentration (T=294 K)

由圖2可知，NaCl的濃度增大時(shí)，F(xiàn)/F0的值幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，證明離子強(qiáng)度的因素對(duì)ETS與LYSO的結(jié)合無(wú)影響，可推斷出ETS-LYSO體系在相互作用過(guò)程中的靜電作用力不是主要作用力[17]，再一次說(shuō)明該體系的結(jié)合主要靠氫鍵和疏水作用力。

2.3 ETS-LYSO體系的三維熒光光譜圖

試驗(yàn)考察了LYSO加入ETS前后的三維熒光光譜圖，見(jiàn)圖3。

(a)LYSO

由圖3可知,(a)圖為未加入ETS前LYSO在發(fā)射波長(zhǎng)343 nm處的熒光強(qiáng)度，明顯高于(b)圖加入ETS后的熒光強(qiáng)度，即加入ETS后，LYSO的熒光強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明ETS對(duì)LYSO發(fā)生熒光猝滅且程度較大，兩者產(chǎn)生了相互作用。

2.4 分子對(duì)接

通過(guò)分子對(duì)接模擬了ETS與LYSO作用的結(jié)合模型，結(jié)果顯示：結(jié)合體系的最低結(jié)合能ΔG0為-23.19 kJ/mol和通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到ΔG=-29.20 kJ/mol之間存在一定誤差，原因可能是ETS與LYSO模擬對(duì)接過(guò)程中排除了溶劑或除氨基酸殘基Trp、Tyr之外的受體的剛性[18]。分子對(duì)接的能量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，其中靜電能(ΔE3)在分子間相互作用中能占據(jù)的比例很小，因此再一次說(shuō)明結(jié)合體系間主要作用力類(lèi)型不是靜電作用。

表3 ETS-LYSO體系的對(duì)接能量Table 3 The docking energy of ETS-LYSO system kJ/mol

ETS與LYSO的最佳結(jié)合模式見(jiàn)圖4中(a)，ETS與溶菌酶的二維相互作用見(jiàn)圖4中(b)，顯示了ETS結(jié)構(gòu)中的羧基和羰基分別與Arg112和Trg63形成了氫鍵相互作用，結(jié)果表明ETS與LYSO的結(jié)合有氫鍵參與。ETS在LYSO中的結(jié)合位置見(jiàn)圖4中(c)，圖4中(d)進(jìn)一步顯示結(jié)合位置周?chē)陌被釟埢瑥慕Y(jié)果來(lái)看，ETS還可以與周?chē)氖杷园被?Trp62、Ala107、Trp108和Val109)形成疏水作用，增強(qiáng)了分子與分子間的親和力。根據(jù)ETS與溶菌酶的結(jié)合模式可以發(fā)現(xiàn)，氫鍵和疏水作用是二者分子識(shí)別的關(guān)鍵作用力。Trp62、Trp63和Trp108等氨基酸殘基在ETS結(jié)合位點(diǎn)附近，可以一定程度上改變?nèi)芫钢猩彼岣浇h(huán)境的極性，進(jìn)而導(dǎo)致溶菌酶的熒光猝滅，與熒光實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致。Asp52殘基和Glu35殘基是LYSO的催化位點(diǎn)，由圖4中(d)可以觀(guān)察到結(jié)合位置在催化位點(diǎn)附近，表明ETS與LYSO的結(jié)合會(huì)影響LYSO的催化位點(diǎn)附近氨基酸殘基的微環(huán)境，從而對(duì)LYSO催化活性產(chǎn)生影響。

圖4 ETS與LYSO的結(jié)合模式圖Fig.4 The binding pattern diagrams of ETS and LYSO

2.5 ETS-LYSO體系的結(jié)合率

為了更深入研究食用色素與蛋白質(zhì)體系的結(jié)合作用，進(jìn)而通過(guò)理論計(jì)算體系的色素結(jié)合率和蛋白結(jié)合率，可以簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)食用色素進(jìn)入人體與蛋白質(zhì)結(jié)合后，對(duì)蛋白質(zhì)自身的性能及對(duì)人體健康的影響。ETS-LYSO體系的結(jié)合率(W)公式如下[19]：

(5)

式中：Q為ETS的總濃度，B為L(zhǎng)YSO的總濃度。

蛋白結(jié)合率為:

(6)

在溫度294，304，308 K下，實(shí)驗(yàn)所用LYSO濃度為2.0×10-6mol/L，ETS的濃度在4.0×10-7～10×10-6mol/L范圍內(nèi)，利用表1的Ka值并結(jié)合公式(5)和(6)，計(jì)算不同溫度下ETS-LYSO體系的蛋白結(jié)合率W(B)分別為57.95%～93.02%(294 K)、40.25%～82.5%(304 K)、13.6%～45.35%(308 K)，蛋白游離率分別為42.05%～6.98%(294 K)、59.75%～17.5%(304 K)、86.4%～54.65%(308 K)。ETS-LYSO體系的色素結(jié)合率W(Q)為57.95%～18.6%(294 K)、40.25%～16.5%(304 K)、13.6%～9.07%(308 K)，色素游離率為42.05%～81.4%(294 K)、59.75%～83.5%(304 K)、86.4%～90.93%(308 K)。以接近人體溫度的308 K為例，可以看出在ETS-LYSO體系中隨著ETS濃度的增大，色素結(jié)合率隨之減少，而游離色素含量增加但變化程度不大。這是由于ETS濃度較高時(shí)，LYSO與ETS結(jié)合沒(méi)有足夠的結(jié)合位點(diǎn)，所以游離色素濃度幾乎不受結(jié)合作用的影響。

結(jié)合率研究的結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)條件下，游離的ETS濃度含量變化較小，說(shuō)明攝入體內(nèi)的ETS受到ETS與LYSO結(jié)合作用的影響很小，但是游離的LYSO含量會(huì)隨著結(jié)合作用顯著降低，同時(shí)結(jié)合分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)的結(jié)論可知ETS與LYSO結(jié)合之后會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，因此可推測(cè)人們攝入ETS之后，會(huì)對(duì)LYSO的抗炎殺菌功能產(chǎn)生一定影響。因此，在ETS的實(shí)際應(yīng)用中要嚴(yán)格控制攝入劑量，ETS在食品中的合理食用提供了理論指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本文采用光譜法和分子模擬對(duì)接研究了ETS與LYSO之間的相互作用，建立了ETS與LYSO的結(jié)合率模型。該方法探究了ETS與LYSO體系的結(jié)合率，并且利用結(jié)合率模型對(duì)LYSO本身抗炎殺菌功能提出了簡(jiǎn)單的預(yù)測(cè)，在某些結(jié)合參數(shù)上可能會(huì)有誤差，但是該方法簡(jiǎn)便快速，適用范圍較廣，為研究食用合成色素類(lèi)小分子物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)分子的性能及人體健康的影響提供了一條新的思路和在食品及調(diào)味品中的合理應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)[20]。