不同時(shí)期增生性瘢痕組織中巨噬細(xì)胞活化相關(guān)因子的研究

李鎮(zhèn)江，李書俊，周 健，陳 偉，楊成蘭，胡 鵬，聶開瑜

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 燒傷整形外科，貴州 遵義 563099)

增生性瘢痕是創(chuàng)面愈合的結(jié)果之一，也是人類真皮特有疾病，能引起程度不等的外形損害和功能障礙，給患者身心健康帶來巨大傷害，因此一直是整形外科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。創(chuàng)面愈合的過程是多種類型細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)共同參與并相互作用的動態(tài)復(fù)雜過程。增生性瘢痕的實(shí)質(zhì)是以纖維結(jié)締組織過度增殖，ECM異常沉積、排列雜亂無序?yàn)樘卣鞯睦w維代謝異常性疾病[1-2]。

炎癥期是創(chuàng)面愈合過程的起始階段，炎癥反應(yīng)對創(chuàng)面愈合的結(jié)局起著重要的調(diào)控作用。過度的炎癥反應(yīng)不僅與創(chuàng)面愈合不良有關(guān)，還會引起ECM異常堆積導(dǎo)致病理性瘢痕形成[3]。而在眾多免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞扮演著極其重要的角色[4]。巨噬細(xì)胞通過分泌相關(guān)炎癥因子，如bFGF、IL-12、IL-10、IL-9、IL-1β、TGF-β、IL-6和VEGF等在愈合過程中發(fā)揮免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)控的作用[5-6]。但是，巨噬細(xì)胞的活化及其活化后的不同亞型，對巨噬細(xì)胞的功能發(fā)揮及創(chuàng)面愈合的結(jié)果產(chǎn)生直接影響[7]。根據(jù)巨噬細(xì)胞活化的具體激發(fā)通路以及活化后其表型和功能的不同，將其分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞；又根據(jù)其在創(chuàng)面愈合中的主要功能不同，M1型巨噬細(xì)胞又稱為為促炎表型巨噬細(xì)胞，而M2型則為抗炎表型或免疫調(diào)節(jié)型巨噬細(xì)胞[8-10]。IL-10和IL-12作為巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志性炎癥因子，其相對表達(dá)量能夠作為巨噬細(xì)胞活化后的不同亞型的定義特征[11]。前者主要由M2型巨噬細(xì)胞分泌，主要發(fā)揮抗炎作用；后者主要由M1型巨噬細(xì)胞分泌，主要發(fā)揮促炎作用[12]。眾所周知，增生性瘢痕組織中存在長期炎癥反應(yīng)，且在臨床表現(xiàn)上存在明顯增生期、減退期和成熟期。因此，巨噬細(xì)胞活化的過程是否參與并影響了增生性瘢痕的形成及臨床轉(zhuǎn)歸，值得研究。

本研究通過對臨床上不同時(shí)期增生性瘢痕組織標(biāo)本中M1型、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志性炎癥因子IL-10和IL-12的研究，通過對比其是否存在差異，從而揭示其與瘢痕形成之間可能存在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 自2018年7月至2020年7月本課題組收集增生性瘢痕手術(shù)切除后的瘢痕組織標(biāo)本，滿足本研究納入標(biāo)準(zhǔn)共計(jì)31例，術(shù)前均取得患者的知情同意，并簽署相關(guān)同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)“溫哥華瘢痕評估量表”中的色澤、厚度、血管分布、柔軟度的描述，再結(jié)合瘢痕形成的具體時(shí)間和瘢痕的臨床癥狀，將瘢痕組織分為A組(增生期)和B組(減退期)。納入標(biāo)椎：A組：色澤(3分)、厚度(2～3分)、血管分布(3分)、柔軟度(2～3分)B組：色澤(2分)、厚度(2～3分)、血管分布(2分)、柔軟度(2～3分)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，A組瘢痕形成時(shí)間為(86±11)天，B組瘢痕形成時(shí)間為(192±14)天。

1.3 樣本預(yù)處理 除了正常術(shù)后送相關(guān)病理檢查的標(biāo)本之外，剩下的標(biāo)本均經(jīng)無菌取材并過無菌生理鹽水清洗，然后去除皮下組織和邊緣正常皮膚組織，最終留取1.0 g，做好標(biāo)記，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑及儀器 OMNI BEAD RUPTOR 24多樣品珠式研磨均質(zhì)儀，1.4 mm直徑陶瓷珠，1 mL研磨管，Odyssey?激光檢測成像系統(tǒng)(美國LI-COR?Biosciences公司)，BioTek 酶聯(lián)免疫分析儀，BCA蛋白定量試劑盒(美國BIO-RAD Laboratories公司)，人炎癥相關(guān)因子抗體陣列印記膜檢測試劑盒(Human inflammatory cytokine Array C1000，RayBiotech公司)，IL-10、IL-12 ELISA檢測試劑盒(IL-10,IL-12 p40 Human ELISA Kit,Thermo Fisher公司)。

1.5 樣本蛋白提取 將增生性瘢痕組織標(biāo)本置于冰盒上，先使用眼科剪將標(biāo)本剪成約2 mm×2 mm大小，每份標(biāo)本分別稱取0.5 g，加1 mL PBS液，接著將混合物置于研磨管，研磨管內(nèi)放入3顆研磨珠，上研磨均質(zhì)儀，以8 m/s的速度的研磨60 s；將研磨后最終獲得的組織勻漿，以離心10 min(離心力為10 000 g)，最后取離心后的上清液-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 總蛋白濃度測定 按照BCA試劑盒內(nèi)原配的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，經(jīng)過稀釋后，配制成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，然后分別配制濃度為0、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)梯度蛋白樣本；在將上述步驟所獲得的蛋白樣品稀釋至合適濃度。分別將標(biāo)準(zhǔn)梯度蛋白樣本和我們需檢測的蛋白樣本，依次加入96孔比色板內(nèi)，隨后加入試劑盒中的BCA工作液，常溫靜置10 min后上酶標(biāo)儀，在595 nm波長下進(jìn)行比色測定，記錄各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；將所測樣品的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到樣本相應(yīng)的蛋白含量，最后根據(jù)具體稀釋倍數(shù)計(jì)算出所測樣本的實(shí)際總蛋白濃度。

1.7 相關(guān)炎癥因子bFGF、IL-12、IL-10、IL-9、IL-1β、TGF-β、IL-6、VEGF表達(dá)的檢測 (抗體陣列印記膜法)根據(jù)檢測試劑盒說明書提供的信息，確定所檢測樣本中的總蛋白合適濃度范圍，并根據(jù)上述測得的不同組樣本總蛋白濃度調(diào)整試劑盒所測的樣本的總蛋白量為一致，然后將試劑盒中的抗體陣列印記膜經(jīng)過預(yù)處理液處理后，分別加入樣本后使用搖床(60 r/min)4 ℃下孵育12 h；去除樣本后Ⅰ、Ⅱ型清洗液先后分別清洗3次，每次不少于5 min，然后加入試劑盒抗體Ⅰ，常溫孵育1 h,再次Ⅰ、Ⅱ型清洗液先后分別清洗3次，隨后加入試劑盒內(nèi)專用熒光顯色劑，常溫孵育45 min，最后加入終止液終止。將印記膜置于Odyssey雙紅外激光成像系統(tǒng)下檢測，并獲得圖像，使用成像系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件，測得抗體陣列印記膜上的標(biāo)準(zhǔn)參照點(diǎn)數(shù)值和每一組發(fā)生反應(yīng)的特定因子的反應(yīng)點(diǎn)的數(shù)值，并將該數(shù)值比上標(biāo)準(zhǔn)參照點(diǎn)數(shù)值的平均值，便獲得該因子的最終表達(dá)的定量數(shù)值，記錄數(shù)據(jù)。

1.8 IL-10、IL-12的檢測(ELISA法) 因抗體陣列印記膜法同時(shí)檢測數(shù)十個(gè)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，可能存在在同一反應(yīng)體系下，印記膜上的抗體存在捕獲蛋白能力的隨機(jī)性差異。為增加結(jié)果的可信度，我們常規(guī)采用ELISA重復(fù)檢測關(guān)鍵炎癥因子表達(dá)。將試劑盒內(nèi)所攜帶的標(biāo)準(zhǔn)蛋白因子試劑，按照說明書的方法加入試劑盒的96孔板中，形成梯度的濃度差，是為標(biāo)準(zhǔn)曲線孔；然后根據(jù)檢測試劑盒說明書提供的信息，確定所檢測樣本中的總蛋白合適濃度范圍，并根據(jù)上述測得的不同組樣本總蛋白濃度調(diào)整試劑盒所測的樣本的總蛋白量為一致后將樣品添加到孔中，透明膜封板后37 ℃條件下孵育15 h，按說明書配制好洗滌液洗滌微孔板，加入檢測抗體，常溫孵育60 min，再次洗滌微孔板后添加底物，常溫避光孵育15 min,待微孔板內(nèi)液體顏色由淡藍(lán)色變?yōu)槿庋劭梢姾簏S色或淡黃色，加入終止液，終止反應(yīng)；上BioTek 酶聯(lián)免疫分析儀檢測并輸出光密度 (OD) 值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔的OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)孔的蛋白因子含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本中的蛋白因子含量值，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 抗體陣列炎癥相關(guān)因子檢測結(jié)果 IL-10和IL-12的相對表達(dá)是M1型和M2型巨噬細(xì)胞的定義特征，M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10和低水平的IL-12。相反，M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-12和最少的IL-10。故A、B兩組的IL-10和IL-12表達(dá)差異能反映組織的瘢痕炎癥情況。與B組比較，A組中IL-12、IL-6、TGF-β的表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)，而IL-10的表達(dá)量則明顯降低(P<0.05,見圖1、表1)。

A：增生期增生性瘢痕組織；B：減退期增生性瘢痕組織；1：bFGF;2:IL-12;3:IL-10;4:IL-9;5:IL-1β;6:TGF-β;7-IL-6;8:VEGF;pos:陽性內(nèi)參。圖1 抗體陣列印記膜檢測增生性瘢痕組織中炎癥因子的表達(dá)譜

表1 經(jīng)Odyssey? Infrared Imaging System分析后各炎癥因子表達(dá)的定量比較

2.2 ELISA相關(guān)炎癥因子檢測結(jié)果 IL-10,IL-12 ELISA檢測結(jié)果 同抗體陣列檢測結(jié)果一致，與B組比較，A組中IL-12的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，而IL-10的表達(dá)量則明顯降低(P<0.05)，并且IL-10表達(dá)量在前二者總表達(dá)量中所占的比值也明顯降低(P<0.05,見表2)。

表2 特異性因子IL-12、IL-10在總蛋白中所占比例的比較

3 討論

以往的關(guān)于增生性瘢痕形成機(jī)制的研究往往集中于對異質(zhì)性的成纖維細(xì)胞及其相關(guān)分子機(jī)制的研究[13]。但目前的研究表明，為中和或平衡真皮組織嚴(yán)重受損后引起的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，組織發(fā)生以膠原纖維為代表的ECM的過度堆積，最終形成增生性瘢痕。因此，持續(xù)的炎癥反應(yīng)可能是病理性瘢痕形成的重要機(jī)制之一。巨噬細(xì)胞作為創(chuàng)面愈合中免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)控的關(guān)鍵細(xì)胞，可能在增生性瘢痕的形成過程中發(fā)揮重要作用。

IL-10和IL-12是組織損傷后炎癥反應(yīng)的兩種主要巨噬細(xì)胞衍生介質(zhì)，分別發(fā)揮抗炎和促炎功能[14]。他們的相對表達(dá)量能夠作為M1型和M2型巨噬細(xì)胞的定義特征[11]。M1型通過釋放高水平的IL-12激活創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)，從而清除病原體、壞死細(xì)胞及組織碎片；而M2型巨噬細(xì)胞釋放的IL-10能夠削弱創(chuàng)面炎癥反應(yīng)并募集成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等促進(jìn)創(chuàng)面局部組織的重塑與修復(fù)[12]。除此之外，在一項(xiàng)基于IL-10基因敲除小鼠的研究中，胎鼠皮膚傷口出現(xiàn)了明顯的膠原異常沉積，待小鼠出生后，傷口局部組織中更是出現(xiàn)了過度的炎癥反應(yīng)和大量巨噬細(xì)胞浸潤[15]。因此IL-10的表達(dá)高低，以及IL-12與IL-10之間表達(dá)的相對比值的高低，可作為M1型巨噬細(xì)胞是否向M2型巨噬細(xì)胞自然轉(zhuǎn)化發(fā)生的標(biāo)志之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與瘢痕增生減退的增生性瘢痕組織相比，瘢痕增生活躍的增生性瘢痕組織中抗炎因子IL-10的表達(dá)明顯更低，而促炎因子IL-12和IL-6與促纖維化因子TGF-β的表達(dá)明顯更高，說明了在典型的增生期的瘢痕組織中仍然存在較為強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。通過比較兩組瘢痕組織中IL-10在同時(shí)期IL-10和IL-12中所占的比值，我們發(fā)現(xiàn)與A組相比，B組IL-10在同時(shí)期IL-10和IL-12中所占的比值明顯更高，這說明了臨床上表現(xiàn)為減退期的增生性瘢痕可能已完成了M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程，這也同增生性瘢痕增生期和減退期不同的炎癥樣臨床表現(xiàn)特點(diǎn)相一致，即增生期瘢痕可見擴(kuò)張的紫紅色血管，瘙癢、疼痛等炎癥樣癥狀明顯；減退期瘢痕逐漸變平變軟，擴(kuò)張血管減少或消失，瘙癢、疼痛等炎癥樣癥狀明顯減輕[16-17]。

綜上所述，巨噬細(xì)胞的活化程度可以作為確定增生性瘢痕具體臨床時(shí)期的分子標(biāo)志之一。如何抑制M1型巨噬細(xì)胞的持續(xù)活化，使M2型巨噬細(xì)胞活化占據(jù)主導(dǎo)地位，從而在創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕形成過程中，讓其更加接近正常創(chuàng)面愈合過程中M1型和M2型巨噬細(xì)胞活化的時(shí)相過渡，可能成為基于巨噬細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)的增生性瘢痕機(jī)制研究的新方向。