基于生物信息學分析肝細胞癌潛在的關鍵基因及miRNA

余春波，李大玉，范 芳，李長福

(遵義醫(yī)科大學 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)病率和死亡率占全球癌癥的第6位和第4位[2]，病毒感染、酒精、肥胖等都可能引發(fā)HCC的發(fā)生，盡管在手術治療、化療方面取得一些進展，但肝癌發(fā)生的分子機制仍然難以捉摸[3]。由于缺乏有效的治療靶點，一直以來都是臨床治療階段的一個難關，隨著癌癥的基因突變和全基因組研究的開展，許多基因在腫瘤的致癌過程中起作用，這可能對開發(fā)有效的肝癌預防和治療方案有用，因此，篩選及鑒定肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵基因和通路，將有助于認識肝癌潛在的發(fā)病機制，以期為臨床尋找更多的診斷方法、治療靶點和預后提供一定的參考。

目前，癌癥研究已進入基因組學數(shù)據(jù)測序時代，將更好地了解癌癥基因變化，確定潛在的基因突變，進一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶點[4]，單張數(shù)據(jù)芯片分析的結果，假陽性率相對較高。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選下載五個數(shù)據(jù)集，通過對正常肝組織和HCC組織基因芯片中的差異基因進行分析，篩選得到關鍵基因和信號通路；進一步驗證關鍵基因在表達水平、病理分期關系、患者生存分析和免疫組化分析，這樣篩選出來的基因可能更具有臨床意義，或將為HCC的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 芯片來源 在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索關鍵詞“Hepatocellular carcinoma”，選擇“Homo sapiens、tissue、Expession profiling by array”，在數(shù)據(jù)集中挑選正常肝組織為對照組，人HCC組織為實驗組。3張基因芯片，GSE14520，GSE84598，GSE84402分別有正常肝組織樣本19、22、14例，人HCC組織樣本有22、22、14例，平臺分別為GPL3921、GPL10558、GPL570；2張miRNA數(shù)據(jù)芯片，GSE98269、GSE57555分別有正常肝組織樣本3、5例，人HCC組織樣本3、5例，平臺分別為GPL20712、GPL18044。

1.2 篩選差異表達基因 利用GEO2R在線分析工具對實驗組和對照組數(shù)據(jù)進行分析，其中以|log2FC(fold change)|≥1.5和P<0.05作為截取標準用于DEGs的篩選，Venn在線制圖工具對3組差異表達基因取交集基因，獲得3組差異表達基因共同上調、下調的DEGs。

1.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡構建及關鍵基因的篩選 將所獲得的3組差異表達基因共同上調、下調的DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構建PPI網(wǎng)絡圖，隨后導入Cytoscape3.7.1軟件，利用軟件自帶MCODE插件進行模塊分析，模板篩選標準[5]：自由度截止值=10，Haircut on，Node Score Cutoff =0.2，K-Core=2，及Max.Depth=100，進而用Cytohubba插件對差異基因用常規(guī)3種算法(Degree、Closeness、Betweeness)進行篩選，每一種算法所得的前10個基因為關鍵基因。

1.4 關鍵基因GO分析及KEGG pathway分析 利用在線DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov)對Cytohubba插件篩選出來的關鍵基因進行GO和KEGG pathway分析。

1.5 關鍵基因的驗證與預后 用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)進行在線分析，以|log2FC|>1、P<0.05為標準對篩選得到的關鍵基因進行表達水平、病理分期關系、患者生存分析等，并用人類蛋白質圖譜(http://www.proteinatlas.org)分析關鍵基因的在HCC組織和正常組織中的免疫組化結果，下載具有代表性的免疫染色圖片。

1.6 關鍵基因的腫瘤免疫細胞浸潤分析 利用TIMER在線網(wǎng)站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)檢測關鍵基因在HCC組織中免疫細胞的浸潤情況。

1.7 關鍵基因的miRNA驗證 將關鍵基因輸入動物microRNA靶標預測和功能注釋數(shù)據(jù)庫(http://mirdb.org/)預測其miRNA，并與2張miRNA數(shù)據(jù)芯片取DEMs，驗證關鍵基因的miRNA，構建Hub Gene—miRNA網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 HCC差異基因及miRNA的篩選 3張基因芯片GSE14520、GSE84598、GSE84402分別篩選出DEGs559個(163個上調基因，396個下調基因)、1 021個(450個上調基因，571個下調基因)、857個(403個上調基因，454個下調基因)，將這3個芯片數(shù)據(jù)集取交集，共同表達上調的DEGs為37個(見圖1A)，共同表達下調的DEGs為127個(見圖1B)。

2.2 HCC差異基因的PPI網(wǎng)絡構建及關鍵基因的篩選 將篩選的164個DEGs導入String數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡(見圖2A)，再用Cytoscape3.7.1軟件的MCODE插件獲得2個重要模板(見圖2B、C)；Hubba插件篩選得到19個Hub基因(見圖3)。

A：上調基因；B：下調基因。圖1 HCC組織芯片差異表達基因篩選

圖2 DEGs之間的PPI網(wǎng)絡和顯著模板分析

A:Degree; B:Closeness; D:Betweennes。圖3 3種算法結果排名前10的基因在網(wǎng)絡中的相互關系

2.3 HCC關鍵基因的GO分析和KEGG通路富集結果 通過把19個Hub基因上傳到DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG通路富集，差異基因生物學過程集中在細胞周期、有絲分裂過程、視黃酸受體信號通路的調控、對類固醇激素及內源性刺激的反應等(見圖4A)；分子功能有酶結合功能和蛋白去乙?；附Y合功能，細胞組成分布在微管、中心體、紡錘體等，信號通路有p53信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂和細胞周期等(見圖4B)。

圖4 HCC組織關鍵基因GO分析和KEGG通路富集

2.4 HCC組織和正常肝組織關鍵基因表達的驗證 通過GEPIA驗證Hub基因在HCC組織和正常肝組織的表達結果顯示：與正常肝組織比較，有3個Hub基因在HCC組織中低表達，7個Hub基因在HCC組織中高表達(P<0.05，見圖5A)，且與HPA數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學結果相一致，而NDC80和TAT未被HPA數(shù)據(jù)庫收錄(見圖5B)；同時驗證Hub基因與HCC患者OS和DFS的關系，結果表明，7個Hub基因高表達組患者的OS情況差于低表達組患者，CYP3A4、ESR1和TAT低表達組患者的OS情況差于高表達組患者(P<0.05，見圖6A)；7個Hub基因的高表達組患者的DFS情況差低于表達組患者，CYP3A4、ESR1和TAT高表達組患者的DFS情況高于低表達組患者(P<0.05，見圖6B)；除此之外，這10個Hub基因的表達與HCC臨床分期差異顯著(P<0.05，見圖6C)。

A:AURKA；B:BIRC5；C:CCNB1；D:CDK1；E:CYP3A4；F:ESR1；G:KPNA2；H:NDC80；I:TAT；J:TOP2A。圖5 關鍵基因在HCC組織與正常肝組織中的表達

A:AURKA；B:BIRC5；C:CCNB1；D:CDK1；E:CYP3A4；F:ESR1；G:KPNA2；H:NDC80；I:TAT；J:TOP2A。圖6 關鍵基因在HCC組織中表達與患者預后分析

2.5 關鍵基因的腫瘤免疫細胞浸潤分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫對差異表達Hub基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，AURKA、KPNA2、CYP3A4和TAT mRNA在肝癌免疫微環(huán)境中與B細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞在肝癌組織的免疫微環(huán)境中的表達明顯相關(P<0.05)；而與腫瘤純度在肝癌組織免疫環(huán)境中的表達無確切關系(P>0.05)；AURKA、KPNA2 mRNA表達水平與免疫細胞呈正相關，表達量增加；而CYP3A4、TAT mRNA表達水平與免疫細胞呈負相關，表達量下降(見圖7)。

BIRC5、CCNB1、CDK1、NDC80和TOP2A mRNA在肝癌免疫微環(huán)境中與腫瘤純度、B細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞在肝癌組織的免疫微環(huán)境中的表達明顯相關(P<0.05)；且都與免疫細胞呈正相關，表達量增加(見圖7)。

ESR1 mRNA在肝癌免疫微環(huán)境中與腫瘤純度、B細胞和巨噬細胞在肝癌組織的免疫微環(huán)境中的表達明顯相關(P<0.05)；而與中性粒細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞和樹突狀細胞在肝癌組織免疫環(huán)境中的表達無相關性(P>0.05)；且都與免疫細胞呈負相關，表達量減少(見圖7)。

圖7 關鍵基因與腫瘤免疫細胞間的相關性

2.6 關鍵基因預測miRNA 將關鍵基因CDK1、CCNB1、NDC80、TOP2A、KPNA2、BIRC5、AURKA、CYP3A4、TAT、ESR1用miRDB數(shù)據(jù)庫進行在線預測miRNA，發(fā)現(xiàn)132個miRNA，與2個miRNA芯片GSE98269、GSE57555取交集，得到共有的hsa-miR-224-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-22-3p這5個miRNA，并構建 Hub Gene—miRNA網(wǎng)絡(見圖8)。

圖8 Hub Gene—miRNA網(wǎng)絡

3 討論

肝癌是全球常見癌癥之一，其發(fā)生發(fā)展與轉移被認為是一個非常復雜的過程，且HCC的5年生存率僅為18%[6-8]，為深入了解其中的分子機制，尋找與HCC密切相關的基因，筆者在GEO數(shù)據(jù)庫檢索篩選得到3張基因表達芯片數(shù)據(jù)集GSE14520、GSE84598和GSE84402，篩選得到164個DEGs并構建PPI網(wǎng)絡，Cytoscape3.7.1軟件篩選排名前十的Hub基因，并進行GO功能和KEGG通路分析，驗證發(fā)現(xiàn)7個上調Hub基因在HCC組織中的表達水平明顯高與正常肝組織，有3個下調Hub基因在HCC組織中的表達水平低于正常肝組織，與免疫組化結果相一致，進而分析Hub基因與HCC患者OS的和DFS相關，且這10個Hub基因的表達與HCC臨床分期相關，提示這些Hub基因具有HCC病理診斷的臨床價值，有助于HCC患者的預后評估。進一步探討Hub基因與腫瘤微環(huán)境免疫細胞浸潤之間的關系，發(fā)現(xiàn)Hub基因在HCC組織的免疫微環(huán)境中的表達明顯相關；與免疫細胞呈現(xiàn)出正相關或負相關，表達量有增加或減少，提示這些Hub基因與HCC腫瘤組織中的免疫細胞的浸潤存在相關性。隨后將10個Hub基因導入miRDB數(shù)據(jù)庫預測得到miRNA并于2張miRNA數(shù)據(jù)芯片GSE98269、GSE57555取交集，得到5個miRNA。

由此筆者推測，這10個關鍵基因CDK1、CCNB1、NDC80、TOP2A、KPNA2、BIRC5、AURKA、CYP3A4、TAT和ESR1可能是肝癌潛在治療的靶點及預后標志物。目前已證實AURKA是肝癌的一個有效藥物靶點，且取得了初步成功，其發(fā)揮的原癌基因作用已探究明確[9-10]，抑制AURKA可促進黑色素瘤免疫的積累[11]，激活p53協(xié)同AURKA拮抗可促進免疫介導的腫瘤清除[5]。TOP2A在肝癌中參與p53途徑、癌癥途徑和細胞凋亡信號傳導途徑等幾種與癌癥相關的關鍵途徑，發(fā)揮原癌基因作用，是肝癌靶向治療中的一個重要靶點[12]，且介導的DNA分裂與腫瘤炎癥微環(huán)境相關，TOP2A是HCC發(fā)生發(fā)展中重要的基因[13]。CDK1與HCC中的免疫細胞浸潤有關[14]，抑制CDK1可防止免疫介導的遠端腫瘤破壞[15]。而KEGG分析發(fā)現(xiàn)Hub基因富集在p53信號通路，p53信號通路異常能促進肝癌惡性增殖，并參與HCC的發(fā)生，p53信號通路關鍵基因p53在正常細胞和癌細胞的代謝中起到重要作用[16]，并與腫瘤免疫、炎癥微環(huán)境相關，由此筆者推測AURKA、TOP2A和CDK1和p53信號通路可能與肝細胞再生及腫瘤免疫、炎癥微環(huán)境相關。

NDC80是染色體正常分離所必需的基因，有絲分裂過程中有重要的作用，異常表達會造成染色體的異常分離，致使染色體不穩(wěn)定，最終導致腫瘤的發(fā)生[17]。ESR1是HCC的關鍵基因、診斷和治療的標志物[18]。CCNB1與HCC免疫細胞侵潤相關[14]。KPNA2基因可能是通過影響G2/M期、p53信號通路進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用[19]。KPNA2參與機體免疫應答，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后中發(fā)揮重要作用，其高表達能夠顯著性增加腫瘤的惡性增殖，與腫瘤的惡性程度密切相關[20-22]。BIRC5是肝癌免疫相關的預后基因[23]。CYP450是體內藥物轉化關鍵的代謝酶[24]。TAT表達異常讓酪氨酸不能有效降解，致使血液及尿液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物明顯增加，這種疾病是酪氨酸血癥Ⅱ型常染色體隱性遺傳病。以上均反映了這個10個關鍵基因作為肝癌診斷、治療靶點的潛在可能性。

通過2張miRNA數(shù)據(jù)芯片GSE98269、GSE 57555篩選得到的差異miRNA，與10個Hub基因導入miRDB數(shù)據(jù)庫預測得到miRNA取交集，得到hsa-miR-224-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-22-3p這5個miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-224-5p被認為是肝細胞癌的最佳生物標志物[25]，在對乙酰氨基酚誘導的人肝毒性中起到自我保護的作用[26]。hsa-miR-144-3p在肝細胞癌患者血清中細胞外囊泡明顯升高[27]。酒精性肝炎疾病中hsa-miR-148a-3p介導CYP2B6下調[28]，hsa-miR-148a-3p通過AGO1依賴性方式在對照和乙醇暴露的肝細胞中促進ADH4表達[29]。miR-130a-3p控制多種癌細胞中的細胞生長，遷移和侵襲[30]，miR-130a-3p通過抑制吉西他濱代謝肝癌細胞中的Smad4調節(jié)細胞遷移和侵襲[30]。小檗堿抑制HepG2細胞生長并上調miR-22-3p表達[31]。梓醇通過調節(jié)miR-22-3p/MTA3信號抑制HCC的細胞增殖、侵襲和遷移[32]。以上均反映了這個5個miRNA在肝癌的診斷、治療靶點的潛在可能性。

綜上所述，對GEO數(shù)據(jù)庫中篩選的3個基因芯片和2個miRNA數(shù)據(jù)芯片進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，HCC發(fā)生的關鍵基因可能是CCNB1、NDC80、CDK1、TOP2A、KPNA2、BIRC5、AURKA、CYP3A4、TAT和ESR1，重要的信號通路可能是卵母細胞減數(shù)分裂和p53信號通路，hsa-miR-224-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-22-3p這5個miRNA可能是HCC關鍵的miRNA，為HCC的分子機制研究和預后判斷提供新靶點，對肝癌的早期診斷和個體化治療，為后續(xù)的實驗研究提供指導。