線粒體動力相關(guān)蛋白1基因在胰腺癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制及其對化療增敏的啟示

鄭澤群， 楊士勇， 劉子君

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)指起源于腺管上皮的腺癌，是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤[1]，具有起病隱匿、惡性程度高、侵襲性強(qiáng)和預(yù)后差等特征，5年生存率不足5%[2]。近年來，我國PC的發(fā)病率及死亡率均呈逐年遞增的趨勢。目前，臨床上治療PC的方案主要是采用根治性手術(shù)聯(lián)合輔助性放化療，以鉑類藥物為主的化療是PC一線化療方案的經(jīng)典和基礎(chǔ)藥物，尤其順鉑(cisplatin，DDP)是代表藥物之一[3]。Yin等[4]研究證實(shí)，DDP治療早期階段PC的療效較好，隨著治療的推進(jìn)，對DDP等化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥是PC治療失敗的主要原因。因此，研究DDP的耐藥分子機(jī)制，尋找有效的DDP增敏藥物靶點(diǎn)，抑制PC進(jìn)展、提高PC患者的預(yù)后及生存質(zhì)量成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本研究通過探討線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamic related protein，Drp1)基因在胰腺癌DDP耐藥中的作用機(jī)制，以期對胰腺癌DDP化療增敏提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 PC標(biāo)本收集 選取2016年1月至2020年12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院行根治性手術(shù)治療的PC患者52例，腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢查確診，臨床資料完整。其中男27例，女25例；年齡35～69(55.3±10.0)歲。腫瘤部位：胰頭31例，胰體尾21例；根據(jù)第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期26例。按照患者是否對DDP耐藥，分為DDP耐藥PC組26例，男14例，女12例，年齡37～69(56.3±10.1)歲；DDP非耐藥PC組26例，男13例，女13例，年齡35～68(54.1±9.12)歲。留取DDP耐藥PC組、DDP非耐藥PC組的癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織(距離PC組織邊緣2 cm以上，經(jīng)病理確認(rèn)無癌細(xì)胞浸潤的正常組織)，置于-80 ℃液氮中保存。本研究經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞來源和培養(yǎng) 親本人PC細(xì)胞株BXPC-3購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。將BXPC-3細(xì)胞接種于含有10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含有1%青霉素/鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，于顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞呈對數(shù)生長用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 DDP耐藥PC細(xì)胞系BXPC-3/CDDP的建立

選用逐漸遞增DDP濃度的方式誘導(dǎo)親本BXPC-3細(xì)胞對DDP耐藥。取對數(shù)生長期的BXPC-3細(xì)胞，接種到含有0.1 μg/ml DDP的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，加入RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；傳代后，在含有0.2 μg/ml DDP的RPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，加入RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；后續(xù)培養(yǎng)逐漸提高DDP誘導(dǎo)濃度為0.4 μg/ml、0.8 μg/ml、1.6 μg/ml，最終獲得一株能耐受1.6 μg/ml DDP的PC細(xì)胞系，命名為BXPC-3/CDDP細(xì)胞。為了維持PC細(xì)胞的DDP耐藥表型，將BXPC-3/CDDP細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.2 μg/ml DDP的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.4 Drp1質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及分組 在GenBank中檢索人Drp1 cDNA序列(基因編號10059 DNM1L)，并據(jù)此設(shè)計(jì)Drp1的引物及探針，其正向序列為：Drp1-HindⅢ, 5′-GAC GAG CTG TAC AAG ATG GAG GCG CTA ATT CCT-3′；反向序列為：Drp1-BamHI, 5′-TTT AAA TTC GAA TTC TCT AGA TCA CCA AAG ATG AGT CTC-3′。pcDNA3.1-Drp1 mut質(zhì)粒：使用QuickChange試劑盒(安捷倫科技公司)進(jìn)行Drp1-C644A定點(diǎn)突變，將Drp1-C644A進(jìn)一步克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中。使用11.5 μl Lipofectamine 2000(美國英杰生命技術(shù)有限公司)與8.25 μl構(gòu)建的pcDNA3.1-Drp1質(zhì)粒、pcDNA3.1-Drp1 mut質(zhì)粒或者pcDNA3.1空載體質(zhì)?；旌?，稀釋于750 μl OptiMEM中，室溫放置30 min，與PC細(xì)胞孵育6 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①pcDNA3.1組，②pcDNA3.1-Drp1組，③pcDNA3.1-Drp1 mut組。將BXPC-3/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后，以20 μg/ml DDP作用細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)分組如下：①DDP組，②DDP+pcDNA3.1-Drp1 mut組，③DDP+pcDNA3.1-Drp1組。

1.5 免疫印跡法(Western blotting)檢測Drp1蛋白表達(dá)水平 采用1 ml蛋白裂解液RIPA將PC組織樣本(20 μg)勻漿成糊狀，4 ℃條件下以15 000×g離心20 min，收集上層胞漿蛋白。取30 μg蛋白，沸水浴使蛋白變性，用10%～12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；用一抗Drp1(ab184247, 英國艾博康公司)及actin(ab8227, 英國艾博康公司)進(jìn)行4 ℃孵育過夜；再與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯影，用Bio-Rad凝膠成像分析儀對印跡條帶進(jìn)行灰度掃描分析，以actin灰度值為內(nèi)參照計(jì)算目的條帶蛋白含量。

1.6 應(yīng)用熒光染料分子探針2，7，-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFDA)檢測PC細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量

將PC細(xì)胞密度調(diào)至1×106/ml，接種至6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒培養(yǎng)48 h，加入H2DCFDA(10 μmol/L)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置30 min，3～5 min混勻1次，使熒光探針與PC細(xì)胞充分結(jié)合；倒置熒光顯微鏡下選擇激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量，以相對未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒的PC細(xì)胞組的熒光強(qiáng)度作為細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.7 新型熒光探針?biāo)穆人囊一讲⑦溥蚧驶ㄇ嗟饣?JC-1)檢測線粒體膜電位 采用JC-1標(biāo)記線粒體，檢測PC細(xì)胞線粒體膜電位變化；將PC細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒培養(yǎng)48 h，加入JC-1染色工作液(10 μmol/L)，37 ℃條件下靜置20 min；熒光顯微鏡下選擇激發(fā)波長485 nm和發(fā)射波長530 nm，檢測JC-1單體的變化，以相對未轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒的PC細(xì)胞組的熒光強(qiáng)度作為細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位。

1.8 ATP生物發(fā)光檢測線粒體ATP水平 將PC細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，接種至6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒培養(yǎng)48 h，通過添加0.6 mg/ml寡霉素前后ATP生成量之差換算線粒體ATP的含量(寡霉素具有抑制線粒體ATP合酶的作用)。采用TD-20/20光度計(jì)(美國特納公司)檢測ATP含量。

1.9 甲基噻唑基四唑(MTT)比色法測定PC細(xì)胞增殖活性 將PC細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，每孔1 000～10 000個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h，以20 μg/ml DDP作用24 h后，每孔加入0.5%MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)上清。每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔的光密度(OD)值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制PC細(xì)胞的生長曲線。

1.10 Transwell法檢測PC細(xì)胞遷移能力 采用膜孔徑為8 μm的Transwell小室(美國康寧公司)檢測PC細(xì)胞的遷移情況。BXPC-3/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后，以20 μg/ml DDP作用24 h，收集細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/ml；取200 μl細(xì)胞懸液置于Transwell小室上室，下室加入500 μl含20% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，下室表面以0.1%結(jié)晶紫染色，在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，隨機(jī)選取3個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)，以此評估PC細(xì)胞的遷移能力。

1.11 流式細(xì)胞儀檢測PC細(xì)胞凋亡情況 BXPC-3/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后，以20 μg/ml DDP作用24 h，胰酶消化；以結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)溶液，室溫避光孵育30 min；于1 h內(nèi)用FACSCalibur系統(tǒng)采用流式細(xì)胞術(shù)分析BXPC-3/CDDP細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果判定：在流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖中，左下象限FITC-/PI-，為活細(xì)胞；右上象限FITC+/PI+，為壞死細(xì)胞；右下象限FITC+/PI-，為凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 Drp1蛋白在PC組織中的表達(dá) 在DDP非耐藥PC組，PC組織與其對應(yīng)的癌旁正常組織的Drp1蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在DDP耐藥PC組，PC組織中Drp1蛋白表達(dá)量低于其對應(yīng)的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1、表1。

R：DDP耐藥PC組織；NR：DDP非耐藥PC組織；N：PC癌旁正常組織圖1 Drp1蛋白在PC組織中的表達(dá)

表1 Drp1蛋白在PC組織中的水平比較

2.2 Drp1基因?qū)C細(xì)胞線粒體功能的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-Drp1組ROS水平增加，線粒體膜電位及線粒體內(nèi)ATP含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-Drp1 mut組中ROS水平減少，線粒體膜電位及ATP含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pcDNA3.1-Drp1組比較，pcDNA3.1-Drp1 mut組ROS水平減少，線粒體膜電位及線粒體內(nèi)ATP含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2、表2)。

表2 Drp1基因?qū)C細(xì)胞線粒體功能的影響比較

圖2 Drp1基因?qū)C細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生的影響 (×200)

2.3 Drp1基因?qū)DP耐藥PC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 與DDP組及DDP+pcDNA3.1-Drp1 mut組比較，DDP+pcDNA3.1-Drp1組細(xì)胞的增殖活性及遷移數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DDP+pcDNA3.1-Drp1 mut組與DDP組細(xì)胞的增殖活性、遷移數(shù)量及凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、4，表3。

圖3 各組BXPC-3/CDDP細(xì)胞的遷移情況 (×200)

圖4 各組BXPC-3/CDDP細(xì)胞的凋亡情況

表3 各組PC細(xì)胞的增殖活性、遷移數(shù)量及凋亡率比較

3 討論

PC臨床治療多采用手術(shù)為主、放療和化療為輔的綜合治療方案，能夠緩解臨床癥狀，縮小原發(fā)病灶，減緩腫瘤復(fù)發(fā)[5]。但手術(shù)切除術(shù)對PC的治療效果有限，因此有效、敏感化療藥物對于PC治療顯得尤為重要。DDP作為一種無機(jī)鉑劑，是針對細(xì)胞周期的非特異性藥物，其對多種腫瘤具有顯著的療效，包括卵巢癌[6]、膀胱癌[7]、惡性淋巴瘤[8]、宮頸癌[9]及結(jié)直腸癌等[10]。DDP可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA-蛋白、DNA鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)等方式，抑制癌細(xì)胞增殖同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，但癌細(xì)胞對DDP誘導(dǎo)的損傷會進(jìn)行自我切除修復(fù)，由此產(chǎn)生類似化療藥物甚至不同機(jī)制的其他化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥現(xiàn)象[11]。盡管DDP對正常細(xì)胞具有毒性作用，并且伴隨耐藥的發(fā)生，但DDP依舊是許多實(shí)體瘤的一線治療方案。由于PC惡性程度極高，病情進(jìn)展迅速，對放化療敏感度逐步降低，因此，尋找有效治療策略增加DDP耐藥PC治療增敏靶點(diǎn)對PC患者尤為重要。本研究誘導(dǎo)了一株獲得性DDP耐藥的PC細(xì)胞株BXPC-3/CDDP，以BXPC-3/CDDP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接慞C細(xì)胞DDP耐藥的機(jī)制及DDP增敏的潛在藥物作用靶點(diǎn)。

近年來，在臨床中發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞對DDP出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，其中線粒體動態(tài)變化在DDP耐藥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[12]。線粒體作為生物細(xì)胞中的一種重要細(xì)胞器，一方面作為細(xì)胞的動力工廠為細(xì)胞提供能量代謝，另一方面參與細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、遺傳、氧化還原和耐藥性的產(chǎn)生。正常情況下，線粒體分裂與融合所形成的動態(tài)平衡對于維持線粒體功能至關(guān)重要，其參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥機(jī)制的形成[13]。作為一種GTP酶，Drp1基因可以介導(dǎo)線粒體分裂、導(dǎo)致線粒體碎片化，誘導(dǎo)線粒體凋亡的發(fā)生。盡管Drp1基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)，但應(yīng)激狀態(tài)下被招募到線粒體，誘導(dǎo)線粒體分裂和(或)線粒體自噬的發(fā)生[14]。研究表明，ROS在缺陷的線粒體中累積，誘導(dǎo)線粒體損傷的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位上的非特異性孔打開，線粒體中凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，由此引發(fā)細(xì)胞受損甚至凋亡[15]。本研究顯示，過表達(dá)Drp1基因可以誘導(dǎo)BXPC-3/CDDP細(xì)胞線粒體ROS的產(chǎn)生，破壞線粒體膜電位的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著減少，即Drp1基因的過度表達(dá)導(dǎo)致BXPC-3/CDDP細(xì)胞線粒體功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)DDP耐藥PC組織中的Drp1蛋白表達(dá)量顯著低于其相應(yīng)的癌旁組織，即DDP耐藥的PC組織中Drp1基因呈現(xiàn)低表達(dá)的特征。因此，由Drp1基因誘導(dǎo)的線粒體分裂與融合動態(tài)失衡可能與PC細(xì)胞DDP耐藥的機(jī)制息息相關(guān)，基于此，以Drp1基因?yàn)榱⒆泓c(diǎn)探索PC細(xì)胞DDP耐藥具有可行性。本研究為進(jìn)一步證實(shí)Drp1基因在DDP耐藥PC中的重要角色，將BXPC-3/CDDP細(xì)胞中過表達(dá)Drp1基因，觀察DDP作用下PC細(xì)胞耐藥性的改變，結(jié)果表明，過表達(dá)Drp1基因與DDP聯(lián)合作用顯著抑制細(xì)胞的增殖活性和遷移數(shù)量，且BXPC-3/CDDP細(xì)胞的凋亡也顯著增加；然而，增強(qiáng)表達(dá)Drp1變異體基因，DDP對BXPC-3/CDDP細(xì)胞的凋亡作用顯著降低，在凋亡誘導(dǎo)前抑制Drp1活性不僅減少線粒體分離，還能延緩Caspase-3的活化劑細(xì)胞死亡過程[16]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Drp1基因不僅能夠誘導(dǎo)PC細(xì)胞線粒體功能紊亂，還能促進(jìn)BXPC-3/CDDP細(xì)胞對DDP的敏感度，改善DDP耐藥細(xì)胞株的化療抗性，其可能通過促進(jìn)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生、破壞線粒體膜電位以及抑制細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，最終促進(jìn)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合Drp1基因治療DDP耐藥的PC的有效性，有望為針對PC的DDP增敏提供新的思路和依據(jù)。