MicroRNA的生成、檢測與功能研究進(jìn)展

解舉民，王雅雯，黃玉迪，謝小林

(1.湖北理工學(xué)院 a.醫(yī)學(xué)院，b.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435003；2.黃石市精神病醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科，湖北 黃石 435000)

MicroRNAs (miRNAs)是一類長度為18～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與生物體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及凋亡、細(xì)胞變異與癌化等多種生理過程。MicroRNAs通過與互補(bǔ)的mRNAs結(jié)合抑制蛋白產(chǎn)生，參與靶基因調(diào)控，具有組織特異性和階段特異性[1]。某些miRNAs控制動植物的發(fā)育，執(zhí)行特定的生物學(xué)功能，在病毒、腫瘤中存在許多調(diào)控靶點，可能成為多種疾病的標(biāo)志物，對疾病的預(yù)防、診斷、預(yù)后檢測具有重要的臨床意義[2]。成熟microRNAs具有序列短、穩(wěn)定性差、表達(dá)量低等特點，致使microRNAs的檢測難度大[3]。

1 MicroRNA

1.1 MicroRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Victor ambros，Rosalind lee和Rhonda feinbaum發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)有一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，長度為22 nt，可以通過抑制核蛋白lin-4基因表達(dá)，調(diào)控線蟲的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，該小分子非編碼RNA序列與lin-4 mRNA的3’UTR(Untranslated Regions, UTR)區(qū)序列互補(bǔ)并抑制lin-4蛋白合成[4]。繼發(fā)現(xiàn)lin-4之后，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)了let-7，不同的是其調(diào)控晚期幼蟲轉(zhuǎn)化為成蟲，二者被命名為小時序RNA (small temporal RNA，stRNA)[5]。

Sanger研究所的科學(xué)家于2002年成立了microRNA Registry數(shù)據(jù)庫，后更名為miRBase，其中的microRNA數(shù)量逐年增多，microRNA成為研究領(lǐng)域的熱點[6]。

1.2 MicroRNA的生物合成過程

一部分miRNA位于內(nèi)含子區(qū)域，與宿主基因同用啟動子和調(diào)控元件，另一部分miRNA有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄本。pri-miRNA是miRNA的前體，通常是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初始轉(zhuǎn)錄本。動物體內(nèi)的pri-miRNA在細(xì)胞核中經(jīng)過Drosha和輔助因子Pasha作用，轉(zhuǎn)化為60多nt的發(fā)卡狀前體miRNA(pre-miRNA)[7]，再由exprotin5將其運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，由Dicer切割為20多nt的雙鏈miRNA，再降解為成熟的單鏈miRNA，與Argonaute(AGO)蛋白組成沉默復(fù)合體(RISC)，引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制[8]。RISC結(jié)合的一條鏈的5’端相對不穩(wěn)定，為了便于區(qū)分，會在miRNA的序號后加上-5p或-3p[9]。

植物中的miRNA序列與動物體內(nèi)的miRNA很少同源，在RNAseⅡ作用下形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，其長度為70～300 nt，進(jìn)而在類Dicer酶DCL1作用下形成per-RNA，(動物體內(nèi)長度為65～70 nt，植物的長度可達(dá)數(shù)百nt)，繼而形成雙鏈miRNA。miRNA甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1對這些miRNA最后一個核苷酸的核糖進(jìn)行甲基化。有研究表明，miRNA的錯誤表達(dá)會導(dǎo)致植物的各種缺陷，在miRNA的生物過程中，lariat RNAs是pre-mRNA剪切過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，影響miRNA的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，lariat RNA通過充當(dāng)誘餌和隔離復(fù)合體的方式來阻止miRNA的加工。

1.3 MicroRNA的作用機(jī)制

動物miRNA與RISC復(fù)合體結(jié)合后，就可對基因產(chǎn)生調(diào)控作用，miRNA通過5’端的種子序列第2～8位核苷酸識別靶基因mRNA3’-UTR的調(diào)控原件，同RISC復(fù)合體一起發(fā)揮作用，miRNA靶向調(diào)控超過5 300個人類基因，占人類基因的30%[10]。在動物細(xì)胞中，若miRNA與靶mRNA完全匹配，則mRNA降解；若部分匹配，則通過抑制靶mRNA的翻譯過程來沉默基因，抑制蛋白質(zhì)合成，但不影響mRNA合成[11]。在植物中，miRNA與靶mRNA是完全互補(bǔ)的，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，但結(jié)合位點不是3’UTR，而是在開放閱讀框(open reading frame, ORF)中[12]。

miRNA的作用機(jī)制分為翻譯抑制和mRNA降解2種途徑。翻譯抑制機(jī)制中的GW182蛋白，通過N端的GW結(jié)構(gòu)域與AGO結(jié)合、C端的沉默結(jié)構(gòu)與其他輔助蛋白(如PABP等)結(jié)合來抑制翻譯。這些結(jié)合蛋白一方面會在轉(zhuǎn)錄之前抑制40S核糖體小亞基和60S核糖體大亞基結(jié)合成80S的核糖體，翻譯起始過程被抑制，另一方面在翻譯過程中會阻止核糖體的延伸，從而終止翻譯。

miRNA抑制翻譯起始有3種機(jī)制：一是抑制核糖體的組裝，進(jìn)而阻止翻譯起始，如內(nèi)源性let-7微核糖核酸蛋白(miRNPs)或(AGO)蛋白與mRNA聯(lián)合抑制翻譯起始過程；二是抑制靶mRNA m7G帽子的存在，抑制起始復(fù)合物的形成；三是抑制polyA 結(jié)合蛋白poly A binding protein (PABP)與mRNA結(jié)合，影響翻譯起始，含有AGO蛋白和GW182的let-7 miRNPs減弱了5’-cap和3’-poly(A)對翻譯過程的協(xié)同增強(qiáng)作用，從而抑制翻譯。miRNA抑制mRNA與核糖體偶聯(lián)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)來發(fā)揮抑制作用，說明有些抑制過程不是發(fā)生在翻譯起始階段。此外，miRNA沉默作用還可以發(fā)生在其他階段，例如let-7a miRNA在HeLa細(xì)胞中調(diào)控mRNA的翻譯過程，let-7a miRNA和miRISC蛋白AGO抑制核糖體的翻譯[13]。

mRNA的切割需要miRNA與靶基因完全匹配。然而，在動物體內(nèi)種子序列之外，這種匹配度卻不高，哺乳動物的4種AGO蛋白中，AGO2具有包裹miRNA并與靶基因結(jié)合切割mRNA的作用[14]。mRNA的降解是miRNA結(jié)合到mRNA的3’-UTR或5’-UTR或CDS區(qū)上，但在5’-UTR上的結(jié)合可能會使轉(zhuǎn)錄起始因子或核糖體進(jìn)入mRNA，反而會激活轉(zhuǎn)錄。miRNA的抑制和mRNA的降解可能是先后發(fā)生的，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA抑制的mRNA并不是立即被降解，而是先聚集在p小體(p-body)中，當(dāng)需要重新啟動這些mRNA時，則會從p小體中釋放，翻譯蛋白質(zhì)，若不需要就會在核糖體中徹底降解[15]。

2 MicroRNA的檢測方法

當(dāng)前microRNA的檢測方法主要有8種，分別為：Northern blotting、實時熒光定量PCR、微陣列法、RAKE、指數(shù)擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、納米粒和酶輔助目標(biāo)核酸分子再循環(huán)法。

3 MicroRNA的功能

3.1 MicroRNA的跨界調(diào)控

植物microRNA的跨界調(diào)控最早于2011年發(fā)現(xiàn)。研究表明，miRNA-168a可與人/小鼠低密度脂蛋白受體適配器蛋白1 (LDLRAP1) mRNA結(jié)合，抑制肝臟中LDLRAP1的表達(dá)，從而降低小鼠血漿中LDL的去除。這說明植物miRNA可以調(diào)節(jié)哺乳動物靶基因的表達(dá)[16]。

MIR2911是一個金銀花(honeysuckle flower, HS)編碼的非典型microRNA。生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報告試驗表明，MIR2911可以靶向多種甲型流感病毒(IAV)，包括H1N1，H5N1和H7N9。實驗發(fā)現(xiàn)MIR2911顯著抑制了H1N1編碼的PB2和NS1蛋白的表達(dá)，表明MIR2911是中藥中發(fā)現(xiàn)的第一個直接針對各種IAVs的活性成分，進(jìn)一步驗證天然產(chǎn)物可以有效地抑制病毒感染[17]。

利用植物源人工microRNAs (amiRNAs)治療HBsAg /HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，在萵苣中表達(dá)2條針對HBV表面抗原基因(HBsAg)的沉默RNA序列siR471和siR519，發(fā)現(xiàn)萵苣水煎劑對HBsAg基因表達(dá)有明顯的抑制作用，長期飼喂HBsAg /HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟損傷減輕，且無毒副作用。利用植物內(nèi)源性miRNA的生物發(fā)生機(jī)制來產(chǎn)生藥用siRNA是解決siRNA穩(wěn)定性問題和減少RNAi治療潛在副作用的一種新方法。植物來源的miRNA可作為一類新的生物活性成分在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生療效，為人類疾病治療提供新思路。

3.2 病毒microRNA的調(diào)節(jié)功能

首個病毒編碼的miRNA是在2004年EB病毒(EBV)感染的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并確定了病毒調(diào)節(jié)宿主和/或病毒基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。成熟的miRNA通過RISC的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[18]。目前，發(fā)現(xiàn)EBV編碼25種前體miRNAs切割產(chǎn)生44種成熟miRNAs，分別由BART(BamH1-A region rightward transcript)和BHRF1(BamH1 fragment H rightward pen reading frame1)基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌患者中，miR-10b基因通過LMP1，Twist1進(jìn)行基因調(diào)控，過表達(dá)miR-10b使鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，也有臨床研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清中EBV編碼的microRNA BART2-5p表達(dá)增高，通過抑制RND3，BART2-5p激活了Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動性，EBV microRNA BART2-5p在促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移中具有新作用。這些已經(jīng)成為鼻咽癌轉(zhuǎn)移及其預(yù)后指標(biāo)或作為治療鼻咽癌的新靶點。

在EBV發(fā)現(xiàn)之后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多病毒編碼的microRNA，如皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)中，HSV-1(miR-H1)，KSHV(miR-K12-3-3p)和3種先前鑒定的病毒miRNA (v-miRs)。v-miRs既可以調(diào)節(jié)宿主功能又具有病毒治病功能，可能參與炎性口腔疾病[19]。輪狀病毒(Rotavirus,RV)是引起嬰兒病毒性腹瀉的主要原因[20]，乙型肝炎病毒(Hepatitis A Virus, HBV)，HBV編碼的HBV-miR-3靶向其轉(zhuǎn)錄本來調(diào)控自我復(fù)制的過程[21]。

3.3 MicroRNA在乳腺癌中的作用

miRNA通過不同的細(xì)胞通路，發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用，miRNA-206是最早發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的miRNA。其通過對EVI-1的負(fù)調(diào)控來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和T47D中下調(diào)miRNA-206的表達(dá)會使ER-α陽性乳腺癌細(xì)胞對三苯氧胺的敏感性增加，增強(qiáng)治療效果。研究表明，轉(zhuǎn)染miR-206后，三陰性乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231細(xì)胞中TM4SF1的表達(dá)下調(diào)，影響細(xì)胞遷移和侵襲，可成為TNBC的潛在治療藥物[22]。miRNA-206在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)比在正常細(xì)胞中的高，通過與全長神經(jīng)激肽-1 mRNA的3’-UTR結(jié)合來影響蛋白表達(dá)。miRNA-206的高表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和病原灶形成[23]。

MicroRNA-34c (miR-34c)在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中表達(dá)量較低，過表達(dá)miR-34c后，可抑制MCF-7和MDA-MD-231乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。miRNA-99a通過與FGFR3 mRNA 3’UTR結(jié)合沉默F(xiàn)GFR3，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長發(fā)育，miR-99a在乳腺腫瘤中下調(diào)后，F(xiàn)GFR3在乳腺腫瘤中的表達(dá)顯著上調(diào)。miR-21通過靶向與凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個抑癌基因，在人類的許多惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)會影響乳腺癌耐藥性的發(fā)生[24]。

4 總結(jié)

作為RNA領(lǐng)域研究熱點的microRNAs，通過多種方式調(diào)控靶基因表達(dá)，參與機(jī)體生長發(fā)育的各個階段以及細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程，是重要的基因表達(dá)調(diào)控方式之一。游離于細(xì)胞外的microRNAs能穩(wěn)定存在于血清中作為疾病(特別是癌癥)，發(fā)生、發(fā)展和診斷的標(biāo)志物，具有操作簡便、高靈敏度、高通量、可控性好、范圍廣、特性識別等優(yōu)點。及早檢測，早發(fā)現(xiàn)，早治療，可以有效地預(yù)防癌癥擴(kuò)散。植物源microRNAs通過消化吸收或注射的方式進(jìn)入動物機(jī)體后，可以實現(xiàn)跨界調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)極大地改變了當(dāng)前疾病治療的界限，拓寬了疾病治療手段，為疾病的診療提供了新的方法。