昆蟲病原線蟲培養(yǎng)及應用

黃 山，馬 娟，甕巧云#

1.河北北方學院 農林科技學院，河北張家口 075000；2.河北省農林科學院 植物保護研究所，河北保定 071000

昆蟲性病原線蟲（Entomopathogenic nematodes，簡稱EPNs）隸屬于線蟲門（Nematoda）、尾感器綱（Secementea）、小 桿 目（Rhabditida），是 指一類專性寄生昆蟲的致病性線蟲，包含斯氏線蟲科Steinernematidae的斯氏線蟲屬Steinernema與新斯氏線蟲Neosteinernema線蟲和異小桿線蟲科Heterorhabditidae的異小桿線蟲屬Heterorhabditis線蟲[1]。

1 昆蟲病原線蟲的生活史

昆蟲病原線蟲常寄生于害蟲的體內，全身呈半透明，細長圓錐狀，中間略圓，兩端稍尖，體表包裹著一層非蛋白質的彈力角質層，并分布著一些橫紋。昆蟲病原線蟲并不是真的分節(jié)動物，它并不具備循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，但有分泌、中樞神經控制系統(tǒng)、消化吸收管理系統(tǒng)、繁殖管理系統(tǒng)，而且有所謂的肌肉系統(tǒng)[1]。

昆蟲病原線蟲的生命可分成3個發(fā)展階段，即卵、幼體和成蟲發(fā)展階段，其中幼蟲一般有4個年齡范圍，在經過4個蛻皮發(fā)展階段以后，即變?yōu)槌上x。在生物環(huán)境中，產生的為感染期幼蟲（Infective Juveniles, IJs），這是線蟲的生存史中具備入侵力量并且可獨立生存于寄主體外的唯一蟲態(tài)。蟲態(tài)不取食，體外覆蓋著經過蛻去的第二齡幼體的表皮（也稱外鞘），對外界條件的耐受性較好。而在消化道中則包括與其共存的嗜線蟲桿菌屬Xenorhabdus和發(fā)光桿菌屬Photorhabdus細胞。在昆蟲病原線蟲侵染期，幼蟲尋找到新宿主之后，便利用宿主表面的天然開口或體壁進入成蟲體腔，進行了一種全新的生活史循環(huán)。

根據(jù)昆蟲病原線蟲生命史的長度，又可將它們分成以下2種：長生命史型和短生命史型。長生命史型線蟲通常在昆蟲體內生長了2～3代，但短生命史型線蟲與其不同，處于短生命史型并不是第2代，而第1代雌成蟲所產生的蟲卵也可以轉變?yōu)榍秩揪€蟲。在生命史領域，有斯氏線蟲科和異小桿線蟲科的不同。斯氏線蟲成蟲生殖方式為兩性生殖，第1代成蟲分為雌雄兩性。而異小桿線蟲第1代成蟲為雌雄同體，第2代才轉變?yōu)榇菩郛愺w線蟲，具有特殊的異型生活史。

2 昆蟲病原線蟲的致病機理

EPNs中產生于消化管中的共生病菌，其侵入寄主機體的方式大多為利用寄主的自然通道或傷口的節(jié)距膜等，當其接觸寄主害蟲機體后，線蟲攜帶的共生病菌進入寄主機體血腔生長，造成宿主機體細胞被損傷，共生菌在害蟲的血腔中形成毒素和抗菌物質。通常，在48 h后，寄主即可發(fā)生敗血癥而死去。昆蟲病原線蟲與共生菌共同消耗害蟲身上的營養(yǎng)并共同生長。當宿主體內的營養(yǎng)已被耗盡時，感染期幼蟲爬出昆蟲身體，不斷尋找新宿主昆蟲，并以此形成對昆蟲病原線蟲生長的可持續(xù)抑制。

此外，共生菌還能夠形成抗生素以控制對其他雜交細菌的污染，這就為線蟲的正常生長、發(fā)育和繁殖創(chuàng)造了理想的生存環(huán)境條件。共生菌也可以對線蟲的成長供給必需的養(yǎng)分，并且共生菌可以形成對其他雜菌不同的抗生素，這也為線蟲的成長與繁殖創(chuàng)造了理想的條件。

昆蟲病原線蟲與其共生菌間是互利互惠的伙伴關系，共生菌根本無法獨立入侵害蟲，只有由線蟲直接將其引入；當昆蟲致病線蟲入侵昆蟲身體血腔后，隨即放出共生菌，共生菌溶解宿主細胞，并供給線蟲養(yǎng)分，促使其不斷成長。在雙方共同結合的情況下，昆蟲致病線蟲就可以對宿主或害蟲造成致命的后果[2]。

3 昆蟲病原線蟲的生態(tài)學特性

目前，昆蟲病原線蟲在生活和生產中得到了越來越廣泛的應用，它的生態(tài)學研究也隨之得到發(fā)展。當昆蟲病原線蟲離開寄主昆蟲后，其在土壤中存活時間的長短與防治效果，主要取決于土壤溫度、濕度、太陽輻射和天敵等環(huán)境因子與生態(tài)因子。

3.1 溫度

溫度是昆蟲病原線蟲能夠正常生長發(fā)育的環(huán)境因素之一，也是其能否成功侵染寄主的關鍵因子。昆蟲病原線蟲只能在適合其品系線蟲的溫度范圍內寄生、生存及繁殖。目前，已經有報道表明，大部分的昆蟲病原線蟲適宜的侵染溫度是（25±1）℃，最適宜的離體培養(yǎng)溫度為 20℃～25℃。一般情況下，0℃～40℃之間是昆蟲病原線蟲可以耐受的溫度，當溫度達15℃以上時，昆蟲病原線蟲就開始活動，線蟲活動和侵染的適宜溫度為20℃～30℃，溫度達35℃～40℃時，線蟲將失去活動能力，甚至全部死亡。線蟲的品系不同，適宜溫度也有所不同。溫度過高則不利于線蟲的存活；溫度過低，線蟲的活動能力也會有所下降。

3.2 濕度

在適宜的水分條件下，生物體才能進行一系列的日常行為，昆蟲病原線蟲的種類不同，對濕度的要求也不同。EPNs喜歡高濕的環(huán)境，但并非濕度越高越好，土壤間隙中存在一定的水分，能夠形成一層水膜，有助于昆蟲病原線蟲在土壤內的移動。昆蟲病原線蟲一般在干燥狀態(tài)下存活的時間較短。當水分條件不足時，有些線蟲的身體會卷曲呈線圈狀，以減少身體與空氣的接觸面積，達到減少水分流失的目的，身體也就逐漸進入脫水狀態(tài)。

3.3 天敵和太陽輻射

已有研究表明，昆蟲病原線蟲的天敵能夠影響其防治害蟲的效果。在土壤中存在的有些生物體，如食線蟲真菌、細菌、原生動物、線蟲、螨類等，以及其他微小節(jié)肢動物的存在，可以影響昆蟲病原線蟲在土壤中的活動。

太陽輻射也對線蟲有很強的殺傷力，當紫外線直接照射到線蟲時，僅需要幾分鐘的時間線蟲就會死亡。如果在濕度較高的環(huán)境下，或借助一些光保護劑（4-氨基苯甲酸等），線蟲的抗輻射能力在一定程度上也能夠得到增強[3-4]。

4 昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)方式

線蟲的培育方法也一直在不斷地發(fā)展，目前，人們認識到的培育法主要有活體培育法、離體培育法、無菌培養(yǎng)法以及單菌培育法。其中單菌培養(yǎng)法又可分成固相和液相兩類培育法。

4.1 活體培養(yǎng)

活體繁殖即侵染期線蟲進入宿主蟲體后，以宿主內的自然有機質為養(yǎng)分，刺激線蟲的生長。目前，我國和國外進行過活體培育的昆蟲中，應用最廣泛的是大蠟螟（Galleria mellonella），用老熟蟲卵作為新宿主，通過這個技術能夠更長時間地保留線蟲的高致病性。

4.2 離體培養(yǎng)

離體培養(yǎng)是一種利用人工培養(yǎng)基繁殖線蟲的技術，主要包括無菌培育、固態(tài)培育和液態(tài)培育。

4.2.1 無菌培養(yǎng)基無菌敷料培養(yǎng)基指在人工培養(yǎng)基組分內添動物肝臟浸出物和牛血清等需要特殊的營養(yǎng)，并在無菌環(huán)境下接種的培養(yǎng)基。

4.2.2 固體培養(yǎng)線蟲的固相單菌培育方法采用了無菌操縱法，將共生細菌和單菌線蟲的物種注射在人工培養(yǎng)基上，然后再加入海綿中，以大規(guī)模培育。早期的線蟲固態(tài)培育大多使用狗飼草、雞內臟以及其余的哺乳動物內臟材料，還有豆粉、酵母膏、小麥油等，基本實現(xiàn)了線蟲的固態(tài)順利培育。同時還用海綿作為線蟲培育的填充物，從而使線蟲的固態(tài)培育順利進入工廠化。

4.2.3 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)法是指在接有共生細菌的液態(tài)培養(yǎng)基上接入線蟲的一級種。Glaser和Stoll在早期分別用小鼠肝勻漿液和小牛肉汁少量培養(yǎng)線蟲，結果發(fā)現(xiàn)動物的組織液對產量有著很大影響。

在過去的15年間，昆蟲病原線蟲的商業(yè)化技術工作已經得到了很大的進展。從早期通過大蠟螟體內活體培育方法實現(xiàn)了昆蟲病原線蟲的增殖與培育，至20世紀80年代，通過在雞汁培養(yǎng)基的體外大量飼養(yǎng)線蟲方法和對線蟲液態(tài)培育2種技術的成功開發(fā)，逐步促使昆蟲病原線蟲的技術研發(fā)與商業(yè)化技術得到普及。而目前，昆蟲病原線蟲的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖方法大多通過固態(tài)培育和液態(tài)飼養(yǎng)技術。

5 昆蟲病原線蟲的應用

隨著人們環(huán)保意識的增強，在注重提高農作物產量的同時，也越發(fā)重視食品安全和環(huán)境保護等方面的問題，生物防治也隨之受到關注，并且在害蟲綜合防治中占據(jù)重要地位。生物防控的環(huán)境污染小，能夠有效減少殘毒遺留，可有效保護天敵，是當今有害生物防控所探討的重點，是有害生物綜合治理的重要方法之一。其中，昆蟲病原線形動物門是一種新興的生物防治技術，有著如下優(yōu)勢：寄主范圍大，對宿主害蟲有高度自主的功能，其自身繁殖速度快、對人畜、植物、有益微生物安全，無毒，在田間使用中還可以與各種殺蟲劑混合應用。同時，EPNs也在許多國家已開展了廣泛的應用，如韓國、日本等地區(qū)[5-6]。從1985年中國在澳大利亞引入了昆蟲病原線蟲的離體培植技術至今，中國已經完成制造了昆蟲病原線蟲中試放大制劑，并已廣泛應用于各種農林業(yè)害蟲防治[7]。

5.1 利用昆蟲病原線蟲防治異遲眼蕈蚊幼蟲

錢秀娟等[8]以甘肅省分離獲得的優(yōu)質昆蟲致病線蟲Steinernema feltiae0619HT品系，以優(yōu)質低毒藥劑吡蟲啉為基礎資料，再通過藥膜法的檢測將吡蟲啉原藥單用、與昆蟲致病線蟲斯氏線蟲Steinernema feltiae0619HT品系混合，結果證明了EPN能夠與吡蟲啉（用量減半）混合，用于預防韭菜異遲眼蕈蚊幼蟲的危害；昆蟲病原線蟲的S. feltiae0619HT品種中，將1 000 IJS/mL和低用量的（3/4LC50即10 mg/L）的吡蟲啉混合后，對異遲眼蕈蚊的毒性明顯增強，從而能夠達到對吡蟲啉減量增效的作用。

趙國玉[9]測試了昆蟲病原線蟲對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲的防治效果，試驗結果顯示，對韭菜遲眼蕈蚊4齡幼蟲產生最良好的侵染作用是對Heterorhabditis bacteriophoraH06、H. indicaLN2 線蟲，對蟲卵的侵染效果最佳的是H. indicaLN2線蟲，并且，氣溫在25℃～30℃之間對幼蟲的侵染效果最佳。

5.2 利用昆蟲病原線蟲防治天牛

陳賢群等[10]研究了不同劑量（250、500、1 000、2 000和4 000 IJs/mL）的2種昆蟲病原線蟲，即小卷蛾斯氏線蟲Steinernema carpocapsae和嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditis bacteriophora對核桃云斑天牛卵和幼蟲的防治效果。施用劑量為4 000 IJs/mL的小卷蛾斯氏線蟲對該天牛卵的校正防治效率可達65.0%，對幼蟲的最終校正防治效率達93.8%；而嗜菌異小桿線蟲對該天牛卵的校正防治效率達39.5%，對該天牛卵的校正防治效率可達82.4%。由此可見，適宜劑量的昆蟲病原線蟲對云斑天牛幼蟲的田間防控效果好于對卵的效果，可以作為云斑天牛的有效防治技術。

錢秀娟[11]以甘肅省昆蟲病原線蟲Steinernema feltiae0619HT和Heterorhabditis megidis0627M 這2個品系為研究對象，研究了昆蟲病原線蟲對蠐螬的致病力。S. feltiae0619HT品系對華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）致死時間較短，而H. megidis0627M 品系的累積致病力較強，通過實驗室室內致病力測定昆蟲病原線蟲侵染蠐螬的適合劑量為3 200 IJS/ H。田間防治效果表明：試驗天然草場施用S. feltiae0619HT和H.megidis0627M線蟲2周后，大栗鰓金龜（Melolntha hippocastanica）蟲口減退率分別為83.8%和79.5%。說明S. feltiae0619HT和H. megidis0627M線蟲品系對甘肅省蠐螬具有較高的防治效果，是一種有效的生防因子。

5.3 利用昆蟲病原線蟲防治蠐螬

范芳芳[12]利用花盆模擬田間試驗，試驗結果表明：當線蟲的含量達到 5 000 IJs/mL時，線蟲對蠐螬的致死率最高可達73.33%，施用高效氯氟聚酯、辛硫磷對蠐螬的致死率分別可達86.67%、83.33%、63.30%，利用線蟲防治蠐螬有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學農藥。

李而濤等[13]對分離到的櫻桃異小桿線蟲Heterorhabditis beicherriana的1個品系，將其命名為LF品系進行試驗，該品系對蠐螬具有比較強的致病力。在室內試驗中，劑量在200 IJs /頭下，對華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita、暗黑鰓金龜H. parallela和銅綠麗金龜Anomala corpulenta幼 蟲 處 理7 d后，3種幼蟲1齡末期幼蟲死亡率均可達70.0%以上；在室外盆栽試驗中，5 000 IJs/盆劑量下處理7 d后，3種幼蟲、2齡中期幼蟲死亡率均達到了80.0%以上。表明櫻桃異小桿線蟲LF品系對華北地區(qū)蠐螬類地下害蟲生防潛能巨大。

6 前景與展望

經過幾十年的研究與發(fā)展，昆蟲病原線蟲的殺蟲劑技術已經從以前的昆蟲病原線蟲發(fā)展為多種昆蟲病原線蟲來防治多種害蟲，微量化學物質與線蟲混合管理的結構變化使得昆蟲病原線蟲在害蟲防治中的應用越來越成熟[14]。

與一次性使用農藥相比，使用EPNs控制隱藏害蟲的效果更好，EPNs可在工廠批量生產。其應用規(guī)模正在逐步擴大，引起了國內外的極大關注。大量針對共生細菌殺蟲蛋白質研究的報告指出，昆蟲病原線蟲及其共生細菌可能成為繼BT以后又一個可以創(chuàng)造殺蟲蛋白質基因的微生物資源，而且隨著該類資源的突變種類越來越豐富。因此，應做好對昆蟲病原線蟲與共生殺蟲蛋白的應用研究，以及在未來農業(yè)害蟲合成中的應用。