蓖麻種質(zhì)資源遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)的SSR分析

王姣梅，汪磊，譚美蓮，汪魏，王玲，嚴(yán)興初，王力軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430062）

蓖麻（Ricinus communisL.）為大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬雙子葉一年生或多年生草本植物[1,2]，原產(chǎn)于非洲，后傳入亞洲、歐洲、美洲等，具有“綠色能源”油料作物之稱[3]。目前，不少蓖麻品種存在產(chǎn)量低、雜種分離現(xiàn)象嚴(yán)重，雜交育種面臨著親本來(lái)源基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。因此，加強(qiáng)蓖麻種質(zhì)資源的收集保存和鑒定評(píng)價(jià)十分重要，不僅是對(duì)蓖麻品種資源的保護(hù)，更是蓖麻育種材料的基礎(chǔ)積累。目前，全球有10個(gè)國(guó)家建立了蓖麻種質(zhì)資源庫(kù)，共收集和保存了蓖麻種質(zhì)資源17 995 份[4]，其中我國(guó)保存的蓖麻資源有3332份。

搜集種質(zhì)資源，并開(kāi)展資源的鑒定評(píng)價(jià)是品種選育的基礎(chǔ)。我國(guó)保存有豐富的蓖麻資源，開(kāi)展種質(zhì)或品種間遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析可為蓖麻育種雜交組配、群體構(gòu)建親本選擇提供參考。目前，國(guó)外已有較多基于不同分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展蓖麻種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道[5～9]，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析也有少數(shù)涉及[10,11]。He 等[12]利用MSAP（甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記對(duì)60 份蓖麻地方種質(zhì)進(jìn)行表觀遺傳多樣性分析，結(jié)果表現(xiàn)為中度變異，種群間變異范圍為3.80%～34.31%；Foster 等[13]利用48 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)來(lái)自45 個(gè)國(guó)家的676 份蓖麻種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，顯示出較低的遺傳變異水平，且分布與地理位置的相關(guān)性不大；Kallamadi 等[14]基于RAPD、ISSR 和SCoT 標(biāo)記對(duì)31 份種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示為中度水平的遺傳變異。此外，還有利用RAPD 和AFLP 等顯性標(biāo)記[15,16]和SSR、EST-SSR 共顯性標(biāo)記[17,18]進(jìn)行不同蓖麻種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析，均表明其遺傳變異相對(duì)較低。近年來(lái)，Sentilvel 等[10]利用45 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)144份核心蓖麻種質(zhì)近等系（從3000多份蓖麻種質(zhì)中選出）進(jìn)行了遺傳變異和群體結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果顯示中度多樣性，77%的種質(zhì)間無(wú)系譜關(guān)系，基因型之間遺傳親緣程度很低，群體結(jié)構(gòu)缺失；Wang 等人[11]利用22對(duì)EST-SSR引物對(duì)基于含油量、脂肪酸組分和國(guó)家來(lái)源挑選出來(lái)的574份蓖麻種質(zhì)開(kāi)展遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示為中等水平的遺傳多樣性（異化系數(shù)為0.53），分為4個(gè)亞類(lèi)，這些類(lèi)群和亞群與地理位置一致。

國(guó)內(nèi)在蓖麻遺傳多樣性方面的研究也有報(bào)道，但主要是集中對(duì)某一地區(qū)的材料進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)。如崔宏亮等[19]基于主要農(nóng)藝性狀對(duì)104 份新疆蓖麻種質(zhì)資源進(jìn)行變異和聚類(lèi)分析；楊婷等[20]和汪亞菲等[21]分別基于表型性狀和SSR標(biāo)記對(duì)302 份和240 份華南野生蓖麻種質(zhì)進(jìn)行了分類(lèi)評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析。但對(duì)來(lái)源于我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)和國(guó)外的蓖麻種質(zhì)缺乏系統(tǒng)的多樣性評(píng)價(jià)和群體結(jié)構(gòu)分析。

前人這些相關(guān)研究對(duì)我國(guó)蓖麻種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、利用和育種都起到了一定參考作用。通過(guò)多年的收集，我們保存有來(lái)自全國(guó)20多個(gè)省市的蓖麻種質(zhì)和少量國(guó)外種質(zhì)3300 多份。為更好地加強(qiáng)蓖麻種質(zhì)資源的提供利用，促進(jìn)我國(guó)蓖麻遺傳改良和雜交育種進(jìn)程，滿足蓖麻育種對(duì)親本選擇的需求，拓寬蓖麻育種親本的遺傳基礎(chǔ)，本研究基于種質(zhì)來(lái)源和前期農(nóng)藝性狀觀察，利用早期開(kāi)發(fā)的86對(duì)基因組SSR 引物，對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)5 個(gè)地區(qū)（16 個(gè)省市）和國(guó)外3 個(gè)國(guó)家的共191 份蓖麻種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，為蓖麻種質(zhì)資源的有效收集、高效保存及育種親本選擇與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

由國(guó)家油料作物種質(zhì)資源中期庫(kù)（依托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所）提供的191 份蓖麻種質(zhì)資源（附表1，詳見(jiàn)首頁(yè)OSID 碼），這些資源分別來(lái)源于國(guó)內(nèi)5 個(gè)地區(qū)（16 個(gè)省市）和其它3 個(gè)國(guó)家（按地理來(lái)源不同分為5個(gè)國(guó)內(nèi)區(qū)域和1個(gè)國(guó)外種群）。

1.2 DNA 提取

采集蓖麻種質(zhì)的嫩葉，利用CTAB 法[22]進(jìn)行DNA 提取，用TE 溶解至100 μL，并在微量核酸蛋白分析儀（Nanodrop 2000）上測(cè)定DNA 濃度及純度，將原液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成及多態(tài)性篩選

隨機(jī)抽取10 份DNA 材料（編號(hào)2、64、96、114、120、134、160、168、184 和190），根據(jù)已公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)資料[23]，選取多態(tài)性較好的96 對(duì)SSR 引物（由上海生物工程有限公司合成）進(jìn)行篩選。SSR 擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序具體如下：PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括20 ng DNA 模板，0.2 μmol/L 正、反引物，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs；1×Buffer，1 U/μL TaqDNA 聚合酶。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3 min；10個(gè)循環(huán)：94℃30 s，65℃（每循環(huán)下降1℃）30 s，72℃45 s；30 個(gè)循環(huán)：94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s；72℃延伸10 min；4℃保存。將篩選中擴(kuò)增效果好、多態(tài)性穩(wěn)定的86對(duì)SSR 引物（引物序列信息附表2，詳見(jiàn)首頁(yè)OSID碼）。

1.4 條帶統(tǒng)計(jì)及聚類(lèi)分析

讀取條帶，根據(jù)條帶有無(wú)建立0、1矩陣，有帶為1，無(wú)帶則為0，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)輸入Excel 表格，建立各標(biāo)記擴(kuò)增譜帶矩陣數(shù)據(jù)。利用PopGene1.32軟件分析SSR 引物有效等位基因數(shù)（Na）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）等多樣性指標(biāo)。利用NTSYSpc 2.10e 和Structure2.3.4 軟件對(duì)蓖麻種質(zhì)分別進(jìn)行遺傳相似系數(shù)和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[24,25]。使用MEGA7.0 軟件進(jìn)行群體間UPGMA 法聚類(lèi)樹(shù)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及遺傳多樣性分析

通過(guò)引物多態(tài)性篩選，從96 對(duì)SSR 引物中獲得86對(duì)帶型清晰、多態(tài)性好的引物，用于191份蓖麻種質(zhì)的遺傳多樣性分析（部分樣品擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1）。86 對(duì)引物在191 份材料中共擴(kuò)增出194 個(gè)等位基因，每對(duì)SSR 引物標(biāo)記的等位基因數(shù)為2～4個(gè)，平均值為2.26 個(gè)。香農(nóng)信息指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Neil’s 多樣性指數(shù)（H）的變化范圍分別是0.04～1.06、0.01～1.00、0.01～0.65 和0.01～0.64，平均值分別為0.54、0.29、0.36 和0.36（表1）。其中，引物GRC504 和GRC536 的等位基因數(shù)最高（4）；引物GRC994 有效等位基因數(shù)最高（2.79），有效等位基因數(shù)最少（1.01）的是GRC798、GRC914 和 GRC953；引物 GRC562、GRC832、GRC837、GRC886 及GRC910 有效等位基因數(shù)與等位基因數(shù)的比值為1.00，說(shuō)明該基因位點(diǎn)上的等位基因在群體中的分布最均勻（見(jiàn)附表3，首頁(yè)OSID碼）。

表1 蓖麻種質(zhì)的遺傳多樣性分析Table 1 Genetic diversity analysis among castor bean accessions

圖1 引物GRC826在部分樣品中的擴(kuò)增情況Fig.1 Amplified profiles for GRC826 primer among some accession

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

基于86 對(duì)SSR 標(biāo)記的帶譜，利用NTSYS-pc 2.10e 分析191 份蓖麻材料的遺傳關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.46～0.96，平均為0.71。其中，遼蓖163 與遼蓖168 的遺傳相似性最大，而西昌15-4與哲資364和通蓖11號(hào)的遺傳相似系數(shù)最低，為0.46，表明西昌15-4 與哲資364 和通蓖11 號(hào)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不同材料之間的遺傳相似系數(shù)值大多分布在0.60～0.80，占69.27%，相似系數(shù)小于0.50 的占0.42%（圖2），說(shuō)明191 份蓖麻種質(zhì)的遺傳多樣性中等。

圖2 191份蓖麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)Fig.2 Genetic similarity coefficient of 191 castor germplasm accessions

2.3 蓖麻種質(zhì)的聚類(lèi)分析

利用MEGA7.0 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析表明：191 份蓖麻種質(zhì)在遺傳距離0.20 處被分成2 個(gè)大類(lèi)群（圖3）。Ⅰ組含79 份材料，占供試材料的41.4%，其中來(lái)自華北、國(guó)外、西南、華中和東北種質(zhì)群的材料分別為37 份、27 份、9 份、5 份和1 份；Ⅱ組則包含112份材料，其中華北35份、國(guó)外1份、西南31份、華中1份、東北38 份和西北6 份。每個(gè)類(lèi)群中均包含不同數(shù)量的各地區(qū)種質(zhì)，并未完全按地理來(lái)源集中聚為相應(yīng)的類(lèi)群，說(shuō)明它們的遺傳親緣關(guān)系與地理來(lái)源沒(méi)有直接關(guān)系。在遺傳距離為0.15處，可進(jìn)一步將這兩個(gè)類(lèi)群劃分為4個(gè)亞群（A、B、C、D）。隨著遺傳相似系數(shù)的增加，來(lái)自同一種質(zhì)群的材料有聚到一起的趨勢(shì)。如C 亞組20 份材料中主要為西北種質(zhì)，僅含1 份華中種質(zhì)群。華北種質(zhì)群的材料在A 和D兩個(gè)亞群中均有分布，但在亞群A中相對(duì)比較集中；東北種質(zhì)群的材料分布在亞群D 中，國(guó)外種質(zhì)和華中種質(zhì)主要分布在A 亞群中，西南種質(zhì)大部分分布在D亞群中。

圖3 191份蓖麻種質(zhì)的UPGMA 聚類(lèi)圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 191 castor bean accessions

2.4 蓖麻種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)

利用Structure2.3.4 軟件對(duì)191 份蓖麻材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析（圖4A），隨著K值的增加，LnP（D）一直上升，無(wú)明顯的拐點(diǎn)，無(wú)法確定最佳群體數(shù)。因此，用ΔK 來(lái)確定K 值的最佳數(shù)目，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK 取得最大值（圖4B）。因此，群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可將191 份蓖麻材料劃分為2 個(gè)類(lèi)群（圖5）。在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中，當(dāng)遺傳組分（Q 值）≥0.6 時(shí)，共有170 份蓖麻材料，被劃分到對(duì)應(yīng)的2 個(gè)類(lèi)群中，表示材料的遺傳背景相對(duì)比較單一；而Q 值＜0.6的，只有21 份，說(shuō)明這21 份蓖麻種質(zhì)具有混合來(lái)源，遺傳背景較為復(fù)雜，無(wú)法明確某一類(lèi)群，因此劃為混合類(lèi)群（表2，附表4，詳見(jiàn)首頁(yè)OSID 碼）。由表2可知，第1類(lèi)群（圖5中紅色部分）含有86份種質(zhì)資源；第2類(lèi)群（圖5中綠色部分）含有84份種質(zhì)資源。在所有的蓖麻材料中，來(lái)源相近的材料劃分類(lèi)群也存在差異，比如來(lái)自內(nèi)蒙古的22 份材料，其中8 個(gè)被劃分到到混合類(lèi)群中；來(lái)自山西的21個(gè)材料多數(shù)劃分到類(lèi)群2 中，其中編號(hào)19 被劃分到混合類(lèi)群中，表明了來(lái)源相近的材料間也存在較大的遺傳結(jié)構(gòu)差異。

表2 191份蓖麻在2個(gè)類(lèi)群中的分布Table 2 Distribution of 191 accessions in two groups

圖4 K值與LnP（D）和ΔK趨勢(shì)變化圖Fig.4 Distribution of K-values with LnP（D）and ΔK

圖5 蓖麻種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Genetic structure analysis of castor bean accessions

3 討論

蓖麻種質(zhì)資源的收集和保存，是育種家開(kāi)展品種選育工作的基礎(chǔ)，也是育種改良成功的關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)蓖麻種質(zhì)資源的生物學(xué)特性，各農(nóng)藝性狀間存在的關(guān)系，都進(jìn)行了很好地分類(lèi)、歸納和總結(jié)[26～28]。由于形態(tài)表型性狀易受環(huán)境等因素的影響，而難以全面真實(shí)地評(píng)價(jià)種質(zhì)的多樣性和親緣關(guān)系。因此，品種選育和種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中，將傳統(tǒng)方法與生物學(xué)相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，探索其遺傳多樣性的豐富程度，掌握其分布規(guī)律及特點(diǎn)，對(duì)優(yōu)質(zhì)蓖麻資源的挖掘利用、育種親本的合理選配、優(yōu)良基因的定位及品種鑒評(píng)等具有極其重要的指導(dǎo)意義。

本研究利用86對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)191份蓖麻種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明其遺傳多樣性處于中等水平，與前人的研究結(jié)果基本一致[6,29]。前人對(duì)來(lái)自印度[30]、中國(guó)[31]、巴西[32]、美國(guó)等[10,11]世界范圍收集的蓖麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，這些研究表明蓖麻種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性中等。在少數(shù)利用分子標(biāo)記進(jìn)行多樣性分析的研究中[15～18]，蓖麻種質(zhì)間遺傳多樣性更低。這可能跟其種屬分類(lèi)只有單一的一個(gè)種，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄有關(guān)，也可能是由于使用的標(biāo)記數(shù)較少，或與分子標(biāo)記的類(lèi)型和種群有關(guān)。因此，在蓖麻的育種工作中，既要擴(kuò)大蓖麻遺傳基礎(chǔ)，增加優(yōu)良親本的選擇，同時(shí)也要進(jìn)一步優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)更多的多態(tài)性引物。

聚類(lèi)分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析是研究種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效方法。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析能反映出材料間基因交流和滲入情況，能更好地說(shuō)明材料間的遺傳結(jié)構(gòu)，有助于育種者準(zhǔn)確地掌握種質(zhì)間的遺傳關(guān)系?；诰垲?lèi)和群體遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)5 個(gè)地區(qū)（16 個(gè)省市）和其它3 個(gè)國(guó)家的191份蓖麻種質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果分為2大類(lèi)群，不同地區(qū)來(lái)源的種質(zhì)相互交錯(cuò)，親緣關(guān)系與地理來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性。Senthilvel等人[10]基于聚類(lèi)主坐標(biāo)分析（PCoA）和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析都表明，自交系中沒(méi)有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。這可能是因?yàn)榻幌祦?lái)自核心集合，在核心構(gòu)成過(guò)程中去除了密切相關(guān)的基因型；或是蓖麻是異交種，個(gè)體之間有廣泛的基因流動(dòng)，使種群分化水平低。因此，在蓖麻的育種中，要利用雜種優(yōu)勢(shì)，選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的親本進(jìn)行雜交，增加后代的遺傳變異。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)5個(gè)地區(qū)（16個(gè)省市）和其它3 個(gè)國(guó)家的191 份蓖麻種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和比較，表明其遺傳多樣性中等。聚類(lèi)和群體結(jié)構(gòu)分析都將這些蓖麻材料劃分為2 個(gè)類(lèi)群，遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示大多數(shù)蓖麻種質(zhì)的遺傳背景相對(duì)比較單一，只有少數(shù)種質(zhì)（21 份）具有混合來(lái)源，遺傳背景較為復(fù)雜。本研究了解了不同地區(qū)和國(guó)家來(lái)源蓖麻種質(zhì)的遺傳關(guān)系，為今后蓖麻育種提供了豐富的材料，這些材料中的一些優(yōu)異種質(zhì)經(jīng)過(guò)系選后有望服務(wù)于蓖麻品種改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新。