花生抗黃曲霉大果種質(zhì)的創(chuàng)制與鑒定

蔣藝飛，喻博倫，丁膺賓，陳偉剛，郭建斌，陳海文，羅懷勇，劉念，黃莉，周小靜，姜慧芳，雷永，晏立英，康彥平，姜成紅，廖伯壽*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢，430062；2.宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌，443004）

花生（Arachis hypogeaL.）是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國是世界最大的花生生產(chǎn)和消費(fèi)國，近十年來花生生產(chǎn)總體持續(xù)發(fā)展，2018年種植面積達(dá)到462萬公頃，單產(chǎn)3752 kg/hm2，總產(chǎn)達(dá)到1733 萬噸，總產(chǎn)量和消費(fèi)量多年持續(xù)居世界首位[1]。然而，花生是一種易受黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物，劇毒且強(qiáng)致癌的黃曲霉毒素（aflatoxins）加大了花生及其制品的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅花生產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、出口貿(mào)易[2,3]和消費(fèi)者健康[4]。而且，隨著花生生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（收獲）方式的改變、全球氣候變暖的加劇，花生黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)也不斷增加[5,6]。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等曲霉屬真菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人及動(dòng)物肝臟、腸道的危害極大，可引起急性中毒，也可以誘發(fā)癌癥[7]。強(qiáng)化黃曲霉毒素污染的治理是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和加工貿(mào)易中的重要任務(wù)，而培育和種植抗黃曲霉的花生品種是消除或降低毒素污染風(fēng)險(xiǎn)最為經(jīng)濟(jì)安全的技術(shù)措施。

國內(nèi)外在花生黃曲霉抗性改良研究方面取得了較大進(jìn)展，發(fā)掘和創(chuàng)制出了具有籽仁侵染抗性、籽仁產(chǎn)毒抗性和莢殼侵染抗性的種質(zhì)資源和品系。Mixon等通過對(duì)100份花生材料的抗性鑒定，篩選到PI337394、PI337409 等抗侵染種質(zhì)[8]；黎穗臨等通過對(duì)270份花生品種資源的鑒定，篩選到梅縣紅衣、湛秋48 等抗侵染種質(zhì)[9]；莊偉建等通過對(duì)32 份花生品系的鑒定，篩選到閩花6 號(hào)、IGCV91284 等抗侵染品系[10]；Mehan 等通過對(duì)502 份材料的鑒定，篩選到了U-4-7-5、VRR245 等抗產(chǎn)毒種質(zhì)[11]；姜慧芳等通過對(duì)716 份核心種質(zhì)的鑒定，篩選到51002-6、ICG12625等抗產(chǎn)毒種質(zhì)[12]；肖達(dá)人等通過對(duì)1517份種質(zhì)的鑒定，篩選到了N1211、N1322 等抗產(chǎn)毒種質(zhì)[13]；邱西克等通過對(duì)276 份核心種質(zhì)的鑒定，篩選到W. h8342、W. h8333 等具有莢殼侵染抗性的種質(zhì)[14]。同時(shí)，初步明確了花生種皮物理結(jié)構(gòu)、莢殼及種皮的完整性與侵染抗性有關(guān)[15,16]，花生若干生化成分如木犀草素、白藜蘆醇等具有抑制產(chǎn)毒的功能[17,18]。但是，國內(nèi)外花生抗黃曲霉育種的進(jìn)展總體較為緩慢，培育的抗病品種較少，我國僅有的幾個(gè)抗黃曲霉花生品種由于莢果小產(chǎn)量潛力低而在生產(chǎn)上應(yīng)用較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需要。因此，迫切需要發(fā)掘抗黃曲霉且具高產(chǎn)潛力的大果花生種質(zhì)并用于抗性育種。

針對(duì)上述問題，本研究以花生高產(chǎn)大果品種中花16 與抗黃曲霉種質(zhì)J11 雜交構(gòu)建的RIL 群體為材料，鑒定黃曲霉侵染和產(chǎn)毒抗性，并結(jié)合前期對(duì)該群體莢果大小的調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，以期獲得具有兼抗黃曲霉侵染和產(chǎn)毒的大果新種質(zhì)，為深化花生黃曲霉抗性改良提供材料支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

中花16×J11 重組自交系群體(RIL) F7、F8共188個(gè)家系。其中，母本中花16 為感病高產(chǎn)品種，父本J11 為抗病小籽材料。人工接種所用黃曲霉菌株為侵染和產(chǎn)毒能力均強(qiáng)的AF2202[19]。

1.2 方法

RIL 群體及其親本于2017 和2018 年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所陽邏試驗(yàn)基地，采用常規(guī)田間管理。收獲曬干后剝殼，選取成熟飽滿、大小形狀均勻一致、無破損、無病斑、無發(fā)芽的籽仁20 粒，浸泡在75%的酒精中3 min，再用無菌水漂洗3 次后進(jìn)行黃曲霉孢子懸浮液接種，接種濃度為每毫升2×106孢子，接種后振蕩使種子表面均勻布滿孢子，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后調(diào)查侵染指數(shù)，依據(jù)表面孢子覆蓋情況分為四個(gè)等級(jí)：0、1、2、3 級(jí)分別表示孢子覆蓋種皮表面積的0、0～25%、25%～50%、50%～100%，計(jì)算公式為PSII=(n1+n2×2+n3×3)×100%/(N×3)，n1、n2、n3 為各級(jí)籽仁數(shù)，N 為總粒數(shù)。調(diào)查侵染指數(shù)后的籽仁經(jīng)酒精消毒后于110℃烘箱中烘60 min，用甲醇提取黃曲霉毒素并用HPLC法檢測毒素含量[20]。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 軟件計(jì)算各性狀的平均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、遺傳力及相關(guān)性；使用Origin 2018 繪制頻率分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生RIL群體黃曲霉侵染抗性鑒定結(jié)果

在2017 年環(huán)境中，抗病花生親本J11 籽仁的侵染指數(shù)為56.0%，感病親本中花16 為87.0%。RIL群體的平均侵染指數(shù)為79.4%，變異范圍46.9%～98.2%。侵染指數(shù)低于50%的家系有3 個(gè)，50%～60%的6 個(gè)，60%～70%的31 個(gè)，70%～80%的55 個(gè)，80%～90%的56 個(gè)，高于90%的36 個(gè)。群體中侵染指數(shù)低于抗病親本J11的家系有5個(gè)，高于感病親本中花16的53個(gè)，侵染抗性存在超親現(xiàn)象。

在2018 年環(huán)境中，抗病親本J11 籽仁的侵染指數(shù)為51.3%，感病親本中花16 為91.1%。RIL 家系的平均侵染指數(shù)為76.6%，變異范圍28.8%～100.0%。侵染指數(shù)低于50%的家系有11 個(gè)，50%～60%的16個(gè)，60%～70%的22個(gè)，70%～80%的48個(gè)，80%～90%的41 個(gè)，高于90%的37 個(gè)。RIL 群體中侵染指數(shù)低于抗病親本J11 的家系11 個(gè)，高于感病親本中花16 的32 個(gè)，抗性也表現(xiàn)出超親現(xiàn)象（圖1）。

利用SPSS 26.0 軟件對(duì)RIL 群體的侵染抗性進(jìn)行方差分析，家系及年份間差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，廣義遺傳力為63.74%（表1）。由此表明，RIL群體不同材料之間存在抗性的遺傳差異，且抗性受環(huán)境影響較大。綜合分析兩年的鑒定結(jié)果，8 份抗黃曲霉侵染種質(zhì)侵染指數(shù)低于58.8%，與J11相當(dāng)。

表1 花生RIL群體侵染指數(shù)和產(chǎn)毒量的方差及遺傳力分析Table 1 Analysis of variance and heritability of PSII and AFT in the peanut RIL

2.2 花生RIL群體的黃曲霉產(chǎn)毒抗性鑒定結(jié)果

在2017 年環(huán)境中，抗病花生親本J11 的黃曲霉毒素含量為49.45 μg/g，感病親本中花16 為158.98 μg/g。 RIL 家系的平均毒素含量138.34 μg/g，變異范圍34.82～336.77 μg/g。毒素含量低于80 μg/g 的家系有28 個(gè)，80～120 μg/g 的50個(gè)，120～160 μg/g 的52 個(gè)，160～200 μg/g 的30 個(gè)，200～240 μg/g 的15 個(gè)，大于240 μg/g 的11 個(gè)。群體中黃曲霉毒素含量低于抗病親本J11的家系有1個(gè)，高于感病親本中花16 的56 個(gè)，產(chǎn)毒抗性存在超親現(xiàn)象。

在2018 年環(huán)境中，抗病親本J11 的毒素含量為76.73 μg/g，感病親本中花16 為175.67 μg/g。RIL家系的平均毒素含量128.32 μg/g，變異范圍39.52～358.84 μg/g。毒素含量低于80 μg/g 的家系有23個(gè)，80～120 μg/g 的64 個(gè)，120～160 μg/g 的48 個(gè)，160～200 μg/g 的26 個(gè)，200～240 μg/g 的9 個(gè)，大于240 μg/g 的家系5 個(gè)。群體中低于抗病親本J11 的家系19個(gè)，高于感病親本中花16的28個(gè)，抗性也表現(xiàn)出超親現(xiàn)象（圖1）。

圖1 侵染指數(shù)和產(chǎn)毒量在2017和2018年的頻率分布Fig.1 Frequency distributions of PSII and AFT in 2017 and 2018

利用SPSS 26.0 軟件對(duì)RIL 群體的產(chǎn)毒抗性進(jìn)行方差分析，家系及年份間差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，廣義遺傳力為60.02%（表1）。由此表明，RIL群體不同材料之間存在抗性的遺傳差異，且抗性受環(huán)境影響較大。綜合分析2017 年和2018 年的鑒定結(jié)果，獲得9份抗黃曲霉產(chǎn)毒種質(zhì)，毒素含量均低于J11（72.44 μg/g），為高產(chǎn)毒家系的25%以下，具有育種利用價(jià)值。

2.3 花生黃曲霉抗性與產(chǎn)量性狀的相關(guān)性分析

本研究所選用花生RIL群體中的籽仁侵染抗性與產(chǎn)毒抗性顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.193。結(jié)合前期[21]RIL 群體的籽仁長（SL）、籽仁寬（SW）及百仁重（HSW）考種數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），發(fā)現(xiàn)PSII和AFT 均與SL、SW 及HSW 顯著正相關(guān)，其中PSII與三個(gè)籽仁性狀的相關(guān)系數(shù)分別為0.284、0.181、0.290，AFT 與三個(gè)籽仁性狀的相關(guān)系數(shù)分別為0.249、0.178、0.268。結(jié)果表明，一般情況下抗侵染的材料也具有產(chǎn)毒抗性，抗侵染和抗產(chǎn)毒的材料籽仁較小。

表2 花生黃曲霉抗性與產(chǎn)量性狀間的相關(guān)性Table 2 Correlation between resistance to A.flavus and yield-related traits

對(duì)上述篩選出的抗侵染和抗產(chǎn)毒材料的莢果及籽仁大小分析，百果重平均138.23 g，變異范圍為110.65～196.94 g，百仁重平均58.48 g，變異范圍為46.68～83.36 g，百果重在150 g 以下的有12 份，190 g 以上的僅1 份，百仁重在60 g 以下的有12 份，80 g 以上的僅1 份，可見這些抗性材料多集中于小果小籽（表3）。其中，QT1107 為兼抗侵染和產(chǎn)毒的大果新種質(zhì)，百果重達(dá)196.94 g，百仁重達(dá)83.36 g，達(dá)到大果型花生品種的百果重標(biāo)準(zhǔn)，可作為后續(xù)抗性育種材料使用。

表3 抗黃曲霉花生種質(zhì)的產(chǎn)量相關(guān)性狀Table 3 Yield-related traits of peanut lines with resistance to A.flavus

3 討論與結(jié)論

黃曲霉毒素污染嚴(yán)重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，是花生產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的重大問題。培育抗黃曲霉花生品種是防控毒素污染最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但目前生產(chǎn)上抗性品種應(yīng)用有限，原因是抗病親本遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗源種質(zhì)綜合表現(xiàn)尤其是產(chǎn)量潛力較差。本研究通過對(duì)源自國際公認(rèn)的抗黃曲霉花生種質(zhì)J11 的重組自交系的兩年表型數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)花生侵染抗性和產(chǎn)毒抗性間存在一定的相關(guān)性，并鑒定獲得了兼抗侵染和產(chǎn)毒的大果新種質(zhì)，為花生黃曲霉抗性育種提供了潛在的抗源材料。

花生抗黃曲霉種質(zhì)的篩選多集中于籽仁的侵染和產(chǎn)毒，也有對(duì)莢殼侵染抗性的篩選，但并未見對(duì)侵染和產(chǎn)毒綜合進(jìn)行篩選的相關(guān)報(bào)道。黃曲霉抗性鑒定需要較多種子材料，且在低世代群體中進(jìn)行篩選易丟失高抗重組類型，加之現(xiàn)有的抗性種質(zhì)鮮有兼抗侵染和產(chǎn)毒的，在很大程度上限制了花生黃曲霉抗性不同機(jī)制的系統(tǒng)研究和聚合。關(guān)于種質(zhì)篩選的開展，廖伯壽等利用RIL7-9群體成功創(chuàng)制出3份含油量高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良、高抗青枯病的花生新種質(zhì)，李威濤等利用F5-F7代RIL 群體篩選出6 份抗青枯病、莢果大和出仁率高的花生新種質(zhì)[22,23]。本研究通過鑒定中花16×J11 RIL 群體F7-F8代侵染抗性與產(chǎn)毒抗性，共篩選出抗侵染材料8份，抗產(chǎn)毒材料9 份，其中QT1068、QT1107 為兼抗侵染和產(chǎn)毒的材料。這些抗性材料中，QT1040侵染指數(shù)比抗病親本J11 低8 個(gè)百分點(diǎn)，QT1158 低6 個(gè)百分點(diǎn)，QT1026、QT1041、QT1068、QT1089、QT1145 毒素含量均比J11 低10 個(gè)百分點(diǎn)以上，侵染抗性和產(chǎn)毒抗性均表現(xiàn)出超親現(xiàn)象，表明通過不同抗性品系的雜交，可獲得優(yōu)良抗性育種材料。本研究中抗病親本J11 為國際公認(rèn)的抗侵染花生種質(zhì)，推測由于高抗侵染使得黃曲霉菌無法定殖于花生內(nèi)部從而無法獲得營養(yǎng)物質(zhì)，最終產(chǎn)生少量黃曲霉毒素，這一機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

通過對(duì)籽仁侵染指數(shù)、毒素含量和籽仁大小的相關(guān)性分析，三者間存在一定程度的正相關(guān)，本研究中的抗病親本J11 侵染指數(shù)低、產(chǎn)毒量低，但籽仁小，產(chǎn)量性狀指標(biāo)過低，多年鑒定百果重約84.65g、百仁重約33.08g。若與經(jīng)濟(jì)性狀好的大果雜交組合則更易在后代家系中創(chuàng)制出大果材料。前人研究發(fā)現(xiàn)花生黃曲霉抗性和莢果大小為數(shù)量性狀，受多基因控制[24,25]，而本研究中感病親本中花16 為高產(chǎn)品種，二者莢果大小差異倍數(shù)為2.55 倍，侵染指數(shù)1.67 倍，產(chǎn)毒量2.36 倍，可見兩親本的遺傳背景有較大差異，是聚合創(chuàng)制抗黃曲霉的大果種質(zhì)的良好組合。結(jié)合對(duì)已篩選的抗黃曲霉種質(zhì)的莢果大小進(jìn)行考察，成功在抗性穩(wěn)定的高世代RIL 家系中鑒定出兼抗侵染和產(chǎn)毒的優(yōu)良大果新種質(zhì)。

連續(xù)兩年對(duì)高世代花生RIL群體進(jìn)行黃曲霉侵染抗性和產(chǎn)毒抗性的表型鑒定，獲得抗侵染種質(zhì)8份，抗產(chǎn)毒種質(zhì)9 份，其中兼抗侵染和產(chǎn)毒種質(zhì)2份，兼抗侵染和產(chǎn)毒的大果種質(zhì)1份。