甘藍(lán)型油菜分枝角度QTL定位及候選基因分析

趙小珍，趙衛(wèi)國(guó)，張春，余坤江，彭門(mén)路，陳鋒，張維，孫程明，李保軍，王灝，王曉東*，張潔夫*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，農(nóng)業(yè) 農(nóng)村部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210014；3.陜西省雜交油菜研究中心，陜西 楊凌，712100）

油菜是我國(guó)第一大油料作物，菜籽油占國(guó)產(chǎn)食用植物油的47%以上[1]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)油脂的需求不斷增強(qiáng)，進(jìn)一步提高油菜產(chǎn)量變得尤為重要。分枝角度指的是有效分枝與主莖形成的夾角，是影響油菜產(chǎn)量的重要株型性狀[2]。研究表明，適度緊湊的株型有利于油菜中下部的通風(fēng)透光、降低病蟲(chóng)害、提高群體光能利用率、提高葉面積系數(shù)和抗倒伏性，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)[3,4]。

植物分枝角度的形成是其感受器官受到重力刺激后，迫使各器官與重力形成最適角度的過(guò)程[5]，重力反應(yīng)的異常會(huì)導(dǎo)致分枝角度的異常[6]。水稻（Oryza sativaL.）的分蘗角度[7]及玉米（Zea maysL.）的莖葉夾角[8]等均受到重力反應(yīng)影響。當(dāng)前，人們普遍認(rèn)為重力反應(yīng)分為4 個(gè)步驟，即重力信號(hào)的感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)、重力信號(hào)造成的生長(zhǎng)素差異性分布及生長(zhǎng)角度的形成[9]。目前就植物重力感受機(jī)制得到普遍認(rèn)可的是淀粉-平衡石假說(shuō)[10]，該假說(shuō)認(rèn)為平衡石細(xì)胞的淀粉體能夠感受重力刺激的改變并作出應(yīng)激反應(yīng)[11]，這里的平衡石細(xì)胞是一種富含淀粉體的高度極化細(xì)胞。植物在感受到重力刺激后隨之引起體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究表明，Ca2+、InsP3（1,4,5-三磷酸肌醇）、pH 等信號(hào)分子獨(dú)自或協(xié)作參與調(diào)控了該過(guò)程[12]。最后，通過(guò)將不同信號(hào)分子傳遞到反應(yīng)器官來(lái)激活下游底物發(fā)揮功能，進(jìn)而完成重力反應(yīng)。Cholodny-Went 假說(shuō)[13]認(rèn)為重力刺激引起生長(zhǎng)素不對(duì)稱性分布，從而引起重力反應(yīng)部位差異性生長(zhǎng)，其在擬南芥重力實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)[14]。除了生長(zhǎng)素，乙烯[15]、油菜素內(nèi)酯[16]等激素也參與了重力反應(yīng)調(diào)控。

1938 年水稻lazy1（la1）突變體的研究首次分析了其分枝（分蘗）角度調(diào)控機(jī)理，該突變體重力反應(yīng)缺陷導(dǎo)致后期分蘗平臥生長(zhǎng)[17]；2007年la1突變體的基因LAZY1被成功克隆[18]。除了LAZY1基因，控制水稻分枝（分蘗）角度的基因TAC1（TILLER ANGLE CONTROL 1）[19]、PROG1（PROSTRATE GROWTH 1）[20]、LPA1（LOOSE PLANT ARCHITECTURE 1）[21]及PAY1（PLANT ARCHITECTURE AND YIELD 1）[22]等相繼被克隆出來(lái)?；騆AZY1在玉米和擬南芥中的同源基因ZmLA1[8]和AtLAZY1[23]，基因TAC1在玉米和桃樹(shù)同源拷貝ZmTAC1[24]和PpeTAC1[25]等，也相繼被克隆。截止目前，部分分枝角度、分蘗角度、莖葉夾角候選基因已在水稻、擬南芥和玉米中被克隆和鑒定，但在油菜上研究較少，尚未有基因克隆的報(bào)道。

近年來(lái)，QTL 定位和GWAS 分析被廣泛應(yīng)用于識(shí)別復(fù)雜的數(shù)量性狀位點(diǎn)，并成功應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜分枝角度性狀的研究中。張倩[26]利用F2群體定位到1 個(gè)分枝角度的QTL，位于LG1 連鎖群，解釋14.16%的表型變異。Liu 等[27]利用包含143 份株系的自然群體進(jìn)行分枝角度的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在A2、A3、A7、C3、C5 和C7 染色體上定位到25 個(gè)顯著QTL，并在A3 和C3 關(guān)聯(lián)位點(diǎn)附近找到了分枝角度基因LAZY1的同源拷貝。Sun 等[28]利用從國(guó)內(nèi)油菜主產(chǎn)區(qū)及歐洲等其它國(guó)家收集來(lái)的520份自然群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，定位到56 個(gè)QTL，共解釋表型變異的51.1%，并在這些區(qū)域預(yù)測(cè)了多個(gè)候選基因，包括LAZY1、SGR2（SHOOT GRAVITROPISM 2）、PIN3（PIN-FORMED 3）、TIR1（TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1）等。Wang 等[29]利用BSA 的方法結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)對(duì)雙親分枝角度差異較大的F2群體進(jìn)行分枝角度精細(xì)定位，最終在A6染色體上檢測(cè)到一個(gè)分枝角度主效QTL，解釋17.17%的表型變異，并在該QTL 的置信區(qū)間內(nèi)篩選到生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因BnaYUCCA6為候選基因。Li 等[30]利用60K SNP 芯片對(duì)472 份油菜核心種質(zhì)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在6 個(gè)不同環(huán)境下進(jìn)行分枝角度表型鑒定，MLM 和MRMLM 模型各檢測(cè)出46 個(gè)和38 個(gè)顯著相關(guān)的位點(diǎn)，分別解釋表型變異的62.2%和66.2%，并根據(jù)同源擬南芥的注釋，首次發(fā)現(xiàn)了定位在油菜中的分枝角度基因TAC1和SGR1等。Shen等[31]利用60K SNP 芯片對(duì)含有208 份株系的DH 群體進(jìn)行基因分型，構(gòu)建遺傳圖譜并進(jìn)行QTL 定位，共定位到17 個(gè)QTL。汪文祥等[32]利用由分枝角度差異顯著親本構(gòu)建的包含163個(gè)株系的DH群體，在2 個(gè)環(huán)境中共定位到17 個(gè)分枝角度QTL，并推測(cè)基因VAMP714，TAC1，IAR和ARF16等為油菜分枝角度的候選基因。以上研究初步獲得了一些油菜分枝角度性狀位點(diǎn)信息，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能揭示該性狀的遺傳機(jī)制。

前期利用油菜60K SNP 芯片，對(duì)包含189 個(gè)株系的甘藍(lán)型油菜重組自交系（RIL）群體進(jìn)行基因分型，構(gòu)建了高密度SNP 遺傳圖譜[33]。本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)RIL群體的分枝角度性狀進(jìn)行考察，結(jié)合高密度遺傳圖譜進(jìn)行QTL 定位與分析，并在穩(wěn)定表達(dá)的QTL 區(qū)間內(nèi)篩選候選基因，為深入解析甘藍(lán)型油菜分枝角度的遺傳機(jī)理，精細(xì)定位和克隆分枝角度相關(guān)基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

前期利用父本Holly和母本APL01，構(gòu)建了一個(gè)包含189 個(gè)株系的RIL 群體并命名為AH。利用油菜60K SNP芯片，構(gòu)建了高密度的遺傳連鎖圖譜，其與甘藍(lán)型油菜參考基因組Darmor-bzh 具有良好的共線性[33]。該圖譜包含2755 bin（含11 458 個(gè)SNP）和57個(gè)SSR，覆蓋甘藍(lán)型油菜全基因組19個(gè)連鎖群的2027.53 cM，標(biāo)記間的平均距離為0.72 cM[33]。利用該群體，前期對(duì)無(wú)花瓣性狀[33]、脂肪酸組分[34]、初花期[35]及耐漬性狀[36]進(jìn)行了QTL 定位及分析。本研究中，AH 群體用于分枝角度的QTL 定位及候選基因分析。

1.2 田間試驗(yàn)

將RIL 群體及其親本于2015 年9 月至2016 年5月種植于江蘇南京和陜西楊凌兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，兩個(gè)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)分別記錄為15NJ 和15YL。田間播種均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)每個(gè)株系種植2行，設(shè)置兩次重復(fù)，行間距40 cm，單株間平均間距20 cm。試驗(yàn)材料的種植、管理和收獲等均按照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)管理方式進(jìn)行。

1.3 表型考察

參考孫程明[37]對(duì)分枝角度測(cè)量的方法，本實(shí)驗(yàn)在油菜成熟后剪取帶有油菜頂部5個(gè)分枝的莖段作為單株的分枝角度，并將其裝袋編號(hào)。在15NJ 和15YL 兩試驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)株系選取5 株進(jìn)行考察，每個(gè)環(huán)境包括兩次重復(fù)。取樣回來(lái)的樣品將其放置在樣品置放板上，利用數(shù)碼相機(jī)拍下能清晰呈現(xiàn)主莖與每一個(gè)分枝節(jié)點(diǎn)夾角的部分，每株5個(gè)分枝共得5張照片，利用計(jì)算機(jī)Photoshop 軟件中的直線工具和角度工具測(cè)量照片中主莖和分枝之間的夾角，并將其記錄到Microsoft Excel文檔中，兩個(gè)重復(fù)的平均值作為株系在一個(gè)環(huán)境的表型值。利用R 軟件[38]計(jì)算其廣義遺傳力。

1.4 QTL定位分析

使用軟件Windows QTL Cartographer 2.5[39]的復(fù)合區(qū)間作圖（composite interval mapping,CIM）法，對(duì)2 個(gè)環(huán)境下分枝角度進(jìn)行QTL 的檢測(cè)。窗口大小設(shè)為10 cM，選用2 cM 的步長(zhǎng)（walking speed），同時(shí)設(shè)置5個(gè)標(biāo)記作為輔助因子。每個(gè)性狀的顯著性水平設(shè)為0.01，進(jìn)行1000 次排列檢驗(yàn)（permutation test），以此來(lái)判斷是否存在QTL，并將其稱為identified QTL。對(duì)于在2 個(gè)環(huán)境下都有表達(dá)且具有重疊置信區(qū)間（confidence intervals,CIs）的QTL 進(jìn)行整合并稱為一致性QTL（consensus QTL）；對(duì)于在2 個(gè)環(huán)境中只檢測(cè)到一次的QTL同樣稱為一致性QTL。QTL的整合應(yīng)用軟件BioMercator V4.2[40]元分析（metaanalysis）法實(shí)現(xiàn)。參考McCouch 等[41]和Wang 等[42]對(duì)QTL的命名的介紹，本研究對(duì)QTL命名，以檢測(cè)到的QTLidentified QTL 英文縮寫(xiě)iq 作為開(kāi)頭，依次加上環(huán)境縮寫(xiě)（15NJ、15YL）和連鎖群編號(hào)（A1-A10、C1-C9）。若在同一個(gè)連鎖群上出現(xiàn)了不止一個(gè)QTL，就依據(jù)順序?qū)ζ溥M(jìn)行編號(hào)。如QTLiq15NJ. C4-1，表示2015 年南京環(huán)境中檢測(cè)到的C4 染色體上的第一個(gè)QTL。對(duì)于經(jīng)元分析整合后的一致性QTL，其命名法則類似上述identified QTL 命名原則，以一致性QTL 英文縮寫(xiě)cq 開(kāi)頭，再依次加上分枝角度性狀縮寫(xiě)（branch angle,BA）和連鎖群編號(hào)。若在同一個(gè)連鎖群上出現(xiàn)了不止一個(gè)一致性QTL，就依據(jù)順序?qū)ζ溥M(jìn)行編號(hào)。例如QTLcqBA. C4-2表示C4 染色體上分枝角度的第二個(gè)一致性QTL。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)

候選基因的定位已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從區(qū)間定位到通過(guò)分析基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息篩選候選基因的階段[43]。本研究利用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)（Illumina，Inc；San Diego，CA，USA），對(duì)雙親APL01 和Holly 基因組進(jìn)行了重測(cè)序，測(cè)序深度為30×，共獲得約249.95 Mb Clean Reads，74.89 Gb Clean Data，Q30平均達(dá)到92.00%。

候選基因的預(yù)測(cè)分為3步：首先，利用重測(cè)序的結(jié)果，在兩親本的全基因組內(nèi)鑒定變異位點(diǎn)；其次，利用遺傳圖譜上SNP 的探針序列，通過(guò)Blast（E 值≤1e-10）將QTL 區(qū)間兩側(cè)的標(biāo)記映射到參考基因組Darmor-bzh 的物理位置[44]，并根據(jù)第一步的結(jié)果，查找QTL 區(qū)間內(nèi)的SNP 位點(diǎn)和InDel 位點(diǎn)及造成非同義突變的SNP 和發(fā)生移碼突變的InDel；第三，以非同義突變的SNP和移碼突變的InDel為目標(biāo)，根據(jù)擬南芥基因的功能注釋篩選分枝角度可能的候選基因。依據(jù)對(duì)現(xiàn)有分枝角度相關(guān)文獻(xiàn)的參考，分枝角度候選基因的選擇偏向于功能注釋中關(guān)于向重力性，生長(zhǎng)素的生物合成、運(yùn)輸及代謝相關(guān)基因。測(cè)序工作由諾禾致源生物信息科技公司（北京）完成，數(shù)據(jù)分析工作由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所油料作物分子改良理論與技術(shù)團(tuán)隊(duì)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體及其雙親分枝角度表型分析

對(duì)RIL群體及親本的分枝角度進(jìn)行了兩個(gè)環(huán)境的考察（圖1、表1）。在15NJ 和15YL 2 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，APL01 的分枝角度分別為25.2°和32.8°，Holly 的分枝角度分別為33.5°和41.9°，兩親本的分枝角度在兩個(gè)環(huán)境中均存在極顯著差異（P＜0.01）（表1）。RIL 群體的分枝角度在兩個(gè)環(huán)境中具有廣泛的變異，平均變異幅度各為24.74°～37.76°和31.05°～46.67°。單個(gè)環(huán)境的最大值大于高值親本，最小值小于低值親本，表現(xiàn)出超親分離現(xiàn)象（圖1、表1），暗示增效等位基因在雙親中都有分布。兩環(huán)境下的分枝角度表現(xiàn)出連續(xù)性分布，表現(xiàn)出明顯的數(shù)量性狀特征，適合用于QTL檢測(cè)（圖1）。R軟件計(jì)算出分枝角度在2 個(gè)環(huán)境下的廣義遺傳力為86%，說(shuō)明油菜的分枝角度主要受遺傳因素控制。

表1 兩環(huán)境下親本及RIL群體分枝角度性狀的統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of branch angle of parents and RIL populations under 2 environments

圖1 AH RIL群體在兩環(huán)境的分枝角度表型頻率分布Fig.1 Phenotypic frequency distributions of branch angle in AH RIL population under 2 environments

2.2 分枝角度QTL檢測(cè)

利用軟件Windows QTL Cartographer 2.5 中的復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL 定位，在15NJ 和15YL 兩環(huán)境中共檢測(cè)到11 個(gè)identified QTL，分布在A9、C3、C4 和C7 染色體上（表2），單個(gè)QTL 解釋表型變異的4.05%～9.60%，加性效應(yīng)范圍為-1.52～1.96。其中有7 個(gè)identified QTL 分布在C4 染色體，每個(gè)QTL 對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率在4.60%～9.60%。利用軟件BioMercator V4.2 將其中5 個(gè)具有重疊置信區(qū)間QTL 整合成2 個(gè)一致性QTLcqBA. C4-2和cqBA.C4-3（表2），這兩個(gè)QTL 均在15NJ 和15YL 被反復(fù)檢測(cè)到。其它6 個(gè)QTL 只在1 個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到（表2），表現(xiàn)出環(huán)境特異性，說(shuō)明環(huán)境對(duì)于這些QTL 位點(diǎn)影響的程度較大，利用它們對(duì)分枝角度進(jìn)行遺傳改良時(shí)，環(huán)境因素不可忽略。經(jīng)過(guò)元分析后，本研究共獲得8個(gè)分枝角度的一致性QTL，其中7個(gè)一致性QTL 的加性效應(yīng)為正值，說(shuō)明其增效基因來(lái)自于母本APL01；另一個(gè)一致性QTLcqBA. A9，具有-1.52 的負(fù)加性效應(yīng)，表明其增效基因來(lái)自于父本Holly（表2）。

表2 甘藍(lán)型油菜分枝角度QTL結(jié)果Table 2 QTL results for branch angle of Brassica napus

2.3 與已報(bào)道的油菜分枝角度QTL的比較

油菜中分枝角度的文獻(xiàn)報(bào)道較少，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的分枝角度性狀定位結(jié)果進(jìn)行整理[26～32]，發(fā)現(xiàn)除了C1染色體外，分枝角度位點(diǎn)在其它染色體上都有分布，其中A3，A7 和C3 染色體分布數(shù)目最多，各有10個(gè)以上位點(diǎn)，其余染色體各有2～7 個(gè)位點(diǎn)。為比較本研究定位的8 個(gè)QTL 和前人報(bào)道的QTL 是一致，將其連鎖/關(guān)聯(lián)的標(biāo)記/探針序列比對(duì)到參考基因組Darmor-bzh 以確定QTL 的物理位置。本研究在A9染色體上定位到一個(gè)QTLcqBA.A9，其位于22.15～23.05 Mb 區(qū)間（表2），通過(guò)與已研究報(bào)道的QTL[28,30]比較，置信區(qū)間沒(méi)有重疊（表3）；在C3 染色體上也定位到一個(gè)QTLcqBA.C3，其位于4.21～4.87 Mb 區(qū)間（表2），通過(guò)與已研究報(bào)道的QTL[27,28,30～32]比較，置信區(qū)間沒(méi)有重疊（表3）；在C4 染色體上定位到四個(gè)QTLcqBA. C4-1（0.082～1.64 Mb），cqBA. C4-2（10.32～14.3 Mb），cqBA.C4-3（44.39～44.46 Mb）和cqBA. C4-4（44.74～46.33 Mb）（表2）。經(jīng)比較，除cqBA. C4-1與汪文祥等[32]的區(qū)間有重疊外，其它3個(gè)QTL 與前人的定位結(jié)果不同[28,30,32]（表3）；在C7 染色體上定位到兩個(gè)QTLcqBA. C7-1（5.73～5.86 Mb）和cqBA.C7-2（30.72～32.18 Mb）與前人的定位結(jié)果均不同[27,28]（表3）。因此，本研究中定位的8 個(gè)QTL，除cqBA.C4-1外，其它7 個(gè)QTL 與前人的定位結(jié)果均不同，推測(cè)為新的控制油菜分枝夾角的QTL位點(diǎn)。

表3 本研究與前人報(bào)道的分枝角度QTL比較Table 3 Comparison of the QTL for branch angle from present and previous reports

2.4 分枝角度候選基因的預(yù)測(cè)

QTLcqBA. C4-2和cqBA. C4-3能在2 個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)（表2），表明這2個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)可能存在控制甘藍(lán)型油菜分枝角度的基因。這2個(gè)QTL均位于C4 連鎖群上，對(duì)應(yīng)物理圖譜上的位置為10.3～14.3 Mb 和44.4～44.5 Mb。根據(jù)Holly 和APL01 的重測(cè)序結(jié)果，在QTLcqBA.C4-2區(qū)間內(nèi)共發(fā)現(xiàn)有7226 個(gè)SNP 和829 個(gè)InDel，其中7226 個(gè)SNP 中包含220 個(gè)非同義突變和5 個(gè)stopgain 突變，829 個(gè)InDel 中有15個(gè)發(fā)生移碼突變，這些突變位點(diǎn)共對(duì)應(yīng)55個(gè)基因（附表1，見(jiàn)首頁(yè)OSID 碼）；在QTLcqBA. C4-3區(qū)間內(nèi)共發(fā)現(xiàn)有416 個(gè)SNP 和65 個(gè)InDel，其中416 個(gè)SNP中包含50個(gè)非同義突變，65個(gè)InDel中有1個(gè)發(fā)生移碼突變，這些突變位點(diǎn)共對(duì)應(yīng)15 個(gè)基因（附表2，見(jiàn)首頁(yè)OSID 碼）。在此基礎(chǔ)上，以這70 個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)，借助擬南芥同源基因的功能注釋，共篩選到4個(gè)分枝角度相關(guān)的候選基因，BnaC04g13100D，BnaC04g15900D，BnaC04g16280D和BnaC04g44330D（表4）。

表4 QTL cqBA.C4-2和cqBA.C4-3置信區(qū)間獲得的候選基因Table 4 Candidate genes in QTL confidence interval of cqBA.C4-2 and cqBA.C4-3

在QTLcqBA.C4-2的置信區(qū)間內(nèi)（10 323 625～14 297 777 bp），共篩選到3 個(gè)油菜分枝角度相關(guān)基因 ，BnaC04g13100D（AT2G31500,CPK24） 、BnaC04g15900D（AT2G28350,ARF10）和BnaC04g16 280D（AT2G28070,ABCG3）。根據(jù)擬南芥基因的功能注釋，CPK24（BnaC04g13100D）為鈣依賴性蛋白激酶編碼基因，CPK基因廣泛分布在植物體的不同組織，其產(chǎn)物CPK 蛋白通過(guò)解讀由各種發(fā)育和環(huán)境刺激觸發(fā)的Ca2+信號(hào)來(lái)參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)[45]。Ca2+作為重要的信號(hào)物質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，已有研究表明，Ca2+參與調(diào)控植物的重力反應(yīng)[12]，當(dāng)重力刺激改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，這些外流Ca2+被CPK 和CaM（鈣調(diào)素）等感知，并將信號(hào)傳遞到下游效應(yīng)器，最終導(dǎo)致植物重力響應(yīng)[46]，其中CPK 參與了重力信號(hào)的傳遞[47]。推測(cè)鈣依賴性蛋白激酶成員基因CPK24（BnaC04g13100D）可能通過(guò)參與重力信號(hào)的傳遞來(lái)調(diào)控分枝角度。Roychoudhry 等[48]研究發(fā)現(xiàn)植物非垂直分枝的生長(zhǎng)不僅僅由重力性因子決定，提出了反重力性抵消因子（antigravitropic offset, AGO），其與重力性因子共同調(diào)控側(cè)枝的生長(zhǎng)角度。這種反重力抵消機(jī)制發(fā)揮作用依賴于生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)，擬南芥生長(zhǎng)素缺陷突變體，在生長(zhǎng)素信號(hào)恢復(fù)之后，分枝角度也隨之減小，生長(zhǎng)素通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控植物分枝角度的形成[49]。本研究在QTLcqBA.C4-2置信區(qū)間內(nèi)篩選到生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor,ARF）中的ARF10（BnaC04g15900D），該基因也存在于前人定位的分枝角度區(qū)間內(nèi)[28]?；駻BCG3（BnaC04g16280D）為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter）家族一員，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物界普遍存在的一類跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?，其通過(guò)消耗ATP產(chǎn)生的能量參與生物活動(dòng)。Sun 等[28]和汪文祥等[32]在其置信區(qū)間相繼篩選出多個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)家族為分枝角度基因，推測(cè)本研究ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)家族基因ABCG3可能為分枝角度候選基因。在QTLcqBA.C4-3的置信區(qū)間內(nèi)（44 386 986～44 459 092 bp）篩選到1 個(gè)油菜分枝角度相關(guān)基因BnaC04g44330D（AT2G3399 0,IQD9），是IQ67結(jié)構(gòu)域家族的成員，該家族成員只與CaM 特異性結(jié)合。CaM 作為Ca2+另一個(gè)重要的傳感蛋白，同樣通過(guò)傳遞鈣信號(hào)，繼而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。Bürstenbinder 等[50]認(rèn)為多個(gè)IQD基因?yàn)锳RF 的潛在靶標(biāo)，其IQD 蛋白作為鈣信號(hào)和生長(zhǎng)素信號(hào)的樞紐來(lái)調(diào)控植物的形態(tài)發(fā)生。因此推測(cè)IQD9可能參與調(diào)控分枝角度。

3 討論

分枝角度是決定作物株型的重要因素，對(duì)于作物合理密植及機(jī)械化收獲有重要意義。迄今為止，在水稻（分蘗角度）、玉米（莖葉夾角）和擬南芥（分枝角度）中已有較多研究，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和鑒定，但在油菜上的研究較少且尚處于定位階段。甘藍(lán)型油菜中，除C1 染色體外，其余染色體均有分枝角度QTL 位點(diǎn)的分布[26～32]，其中A3、A7 和C3上的分布數(shù)目最多，各有10個(gè)以上位點(diǎn)。本研究在兩個(gè)環(huán)境中，共定位到8 個(gè)QTL，分布在A9、C3、C4和C7 染色體上。通過(guò)和前人研究中報(bào)道的分枝角度QTL 的物理位置比較發(fā)現(xiàn)，定位的8 個(gè)QTL 除cq-BA. C4-1外，其它7 個(gè)QTL 與前人報(bào)道的油菜分枝角度QTL 均沒(méi)有重疊，推測(cè)是新的油菜分枝角度QTL位點(diǎn)。

本研究對(duì)在2 個(gè)環(huán)境中均穩(wěn)定表達(dá)的QTLcq-BA.C4-2和cqBA.C4-3進(jìn)行了候選基因的預(yù)測(cè)，共篩選到4 個(gè)油菜分枝角度相關(guān)基因，BnaC04g13100 D（CPK24）、BnaC04g15900D（ARF10）、BnaC04g1628 0D（ABCG3）和BnaC04g44330D（IQD9）。CPK24僅依賴于Ca2+信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[51]，而重力刺激會(huì)引起Ca2+的變化[52]，同時(shí)有研究表明CPK 參與了重力信號(hào)的傳遞[47]。此外，有報(bào)道[53]稱CPK 可以通過(guò)磷酸化其載體進(jìn)而影響植物體內(nèi)生長(zhǎng)素水平，如定位于質(zhì)膜上的AtCRK5（CPK-related kinase 5）通過(guò)磷酸化生長(zhǎng)素輸出載體AtPIN2，導(dǎo)致其生長(zhǎng)素水平降低，重力反應(yīng)延遲。因此，推測(cè)重力因素的改變引起Ca2+信號(hào)發(fā)生變化繼而被CPK24識(shí)別，通過(guò)影響生長(zhǎng)素運(yùn)輸進(jìn)而控制分枝角度的形成。ARF10為生長(zhǎng)素響應(yīng)因子之一，能夠與生長(zhǎng)素特異性地結(jié)合，以此影響植物的分枝。Sun 等[28]、Shen等[31]和汪文祥等[32]也在其置信區(qū)間相繼篩選出ARF10和ARF16為分枝角度基因。ABCG3為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白一員，通過(guò)消耗ATP 產(chǎn)生的能量來(lái)進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，并主要運(yùn)輸植物激素。有研究者表明[54]，ABCG36 為一種定位于質(zhì)膜上的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其突變體pdr8（ABCG36 缺陷型）在生長(zhǎng)素前體IBA（吲哚-3-丁酸）轉(zhuǎn)運(yùn)上表現(xiàn)出缺陷。此外，ABC超家族PDR 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接參與分枝角度的形成[55]。因此，推測(cè)ABCG3可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素運(yùn)輸直接或者間接影響油菜分枝角度。IQD9 屬于IQD（IQ67-domain containing protein）基因家族蛋白，只與CaM特異性結(jié)合。研究表明，IQD 蛋白作為鈣信號(hào)和生長(zhǎng)素信號(hào)的中介來(lái)調(diào)控植物的形態(tài)發(fā)生[50]，擬南芥和番茄中已證實(shí)了IQD家族基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致莖葉等形態(tài)的改變[56,57]。因此，推測(cè)IQD9可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素信號(hào)和鈣信號(hào)來(lái)影響油菜分枝角度。

本研究利用油菜基因組序列信息及親本的重測(cè)序結(jié)果，從穩(wěn)定表達(dá)的QTLcqBA. C4-2和cqBA.C4-3區(qū)段內(nèi)，篩選出4 個(gè)油菜分枝角度的候選基因，為進(jìn)一步理解分枝角度形成的分子機(jī)理提供了有價(jià)值的信息。