Nrf2激活劑RTA-403抗阿爾茨海默病活性研究

馬沛沛 黃 青 魏世杰 王志忠▲

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，寧夏銀川 750004

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是進行性認(rèn)知障礙和記憶能力損傷為特征的疾病[1]。世界衛(wèi)生組織估計，到2050年AD患者可能接近1.14億例[2]。目前不能完全治愈AD，尋找有效可行的AD治療手段十分迫切[3]。

AD可能與氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）有關(guān)，是組織氧化還原平衡發(fā)生了改變[4]。OS被認(rèn)為是多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機制之一[5]，當(dāng)活性氧自由基產(chǎn)生超過細(xì)胞抗氧化能力時會發(fā)生OS[6]。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2 related factor 2，Nrf2）在OS條件下會發(fā)揮抗氧化保護作用[7]。Nrf2隨著年齡的增長而降低[8]，導(dǎo)致OS反應(yīng)失衡[9]。β淀粉樣蛋白（beta amyloid protein，Aβ）的異常沉積是AD主要發(fā)病機制之一[10]。在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，有Aβ斑塊的出現(xiàn)[11]。Nrf2能保護神經(jīng)干細(xì)胞免受Aβ的毒性反應(yīng)[12]。因此，本實驗將在小鼠模型上考察Nrf2激活劑RTA-403抗AD的藥效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組在正式實驗前，小鼠 適 應(yīng) 性 飼 養(yǎng) 一 周，溫 度（22±2）℃，濕 度45%～65%，明暗周期12 h。采用2周齡的野生型（wild type，WT）小鼠、Nrf2基因敲除小鼠、顱內(nèi)注射Aβ小鼠，體重20 g左右，雌雄各半，隨機分為六組：WT組、Nrf2基因敲除組、Aβ組、WT+RTA-403組、Nrf2基 因 敲 除+RTA-403組、Aβ+RTA-403組，每組各15只，其中前三組小鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，后三組小鼠均給予含有RTA-403[50 mg/（kg·d）]體積分?jǐn)?shù)的飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器Nrf2基因敲除小鼠從美國Jackson實驗室引進。RTA-403 （MedChemExpress 公司）；重組Anti-beta Amyloid（Aβ）抗體[mOC64]（abcam 公司）；實驗用水為蒸餾水。WT、Aβ組均為C57BL /6J 小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，質(zhì)量合格證號： SCXK（寧）2020-0063。LW-Morris水迷宮實驗設(shè)備（上海洛維生物科技有限公司） ；Y迷宮實驗設(shè)備（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；小鼠代謝籠、小鼠體重秤、動物血糖測試儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Aβ模型（AD模型）的建立參照有關(guān)文獻(xiàn)[13]，小鼠乙醚麻醉后，用10 μl微量進樣器側(cè)腦室一次性注入3 μl凝聚態(tài)Aβ抗體（含Aβ抗體3 μg，37℃ 96 h使其成凝聚態(tài)），留針1 min[14]。

1.2.2 水迷宮實驗水迷宮實驗在LW-Morris設(shè)備中進行，其為圓形宮體，在target象限中心水面下1 cm處放置一平臺，池內(nèi)水溫（22±2）℃[15]。實驗在第8周開展，持續(xù)6 d，前5 d為訓(xùn)練階段，每天上午和下午均進行一次，設(shè)置程序為“定位航行測試”，將小鼠從每個象限的中點放入水中，開始記錄，待小鼠找到隱藏平臺時，停止記錄，所用時間即為潛伏期。無論小鼠是否找到平臺，每次結(jié)束后，都將其放置在平臺上訓(xùn)練30 s[16]。第6天為測試實驗，記錄6組小鼠的潛伏期。

1.2.3 Y迷宮實驗Y迷宮由黑色亞克力板組成等長的3個臂（30 cm×6 cm×15 cm）[17]，每臂底部及交界處均鋪設(shè)電熱板，頂部裝有12 W的信號燈[18]。實驗開始時隨機選擇1個臂亮燈、不通熱為安全區(qū)，其余2個臂不亮燈及交界處均通熱（60℃～80℃）為非安全區(qū)[19]。在實驗的第4、6、8周，將小鼠分別依次放入Y迷宮中適應(yīng)20 s后，打開安全區(qū)信號燈，然后將小鼠放到起始臂中，小鼠受到熱刺激后成功逃到安全區(qū)且停留5 s，將此視為1次訓(xùn)練。每只小鼠重復(fù)訓(xùn)練直到達(dá)標(biāo)為止（連續(xù)20次訓(xùn)練中≥18次正確即為達(dá)標(biāo)）[20]。最后比較第6、8周，6組小鼠30次實驗內(nèi)訓(xùn)練及錯誤的次數(shù)。

1.2.4 生理生化指標(biāo)實驗第9周，稱量記錄每只小鼠的體重。使用代謝籠，配上糞尿分離漏斗收集每只小鼠的尿量。用毛細(xì)管刺小鼠內(nèi)眥處取血，分離血清30～40 μl，使用便攜式血糖儀檢測每只小鼠的血糖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用方差分析，方差齊時用配對樣本t檢驗，方差不齊時用t’檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組小鼠的水迷宮實驗比較

Nrf2基因敲除組潛伏期長于WT組（P＜ 0.01），Aβ組潛伏期長于WT組（P＜ 0.01）。而WT+RTA-403組相對于WT組潛伏期無明顯變化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403組相對于Nrf2基因敲除組潛伏期沒有明顯縮短（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403組相對于Aβ組潛伏期顯著縮短（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 六組小鼠水迷宮潛伏期（n=15）

2.2 六組小鼠Y迷宮實驗比較

第6周和第8周的錯誤次數(shù)：Nrf2基因敲除組與WT組相比，明顯增多（P＜ 0.01），Aβ組與WT組相比，明顯變多（P＜ 0.01）。WT+RTA-403組與WT組相比，無明顯變化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403組與Nrf2基因敲除組相比，無明顯變化（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403組與Aβ組相比，明顯減少（P＜ 0.05），見表1。

表1 六組小鼠Y迷宮訓(xùn)練次數(shù)和錯誤次數(shù)比較（次，±s）

表1 六組小鼠Y迷宮訓(xùn)練次數(shù)和錯誤次數(shù)比較（次，±s）

注 第六周：■與◆比較，t=5.266，P=0.0001 ＜ 0.01；▲與◆比較，t=3.878，P=0.002 ＜ 0.01；×與◆比較，t=0.311，P=0.761 ＞ 0.05；+與■比較，t=-0.371，P=0.716 ＞ 0.05；●與▲比較，t=-2.495，P=0.026 ＜ 0.05。第八周：■與◆比較，t=8.829，P=0.0001 ＜ 0.01；▲與◆比較，t=6.929，P=0.0001 ＜ 0.01；×與◆比較，t=-0.281，P=0.783 ＞ 0.05；+與■比較，t=-0.572，P=0.567 ＞ 0.05；●與▲比較，t=-5.667，P=0.0001 ＜ 0.01

組別 n 訓(xùn)練次數(shù) 錯誤次數(shù)第6周 第8周 第6周 第8周WT組 15 20.20±1.30 20.30±1.00 12.24±1.90◆ 10.40±2.10◆Nrf2基因敲除組 15 19.70±1.40 19.80±1.50 14.65±1.70■ 16.71±2.30■Aβ組 15 19.90±1.50 20.00±1.20 14.48±1.30▲ 16.33±1.90▲WT+RTA-403組 15 20.20±1.20 20.30±0.80 12.21±1.90× 10.37±3.10×Nrf2基因敲除+RTA-403組 15 19.75±1.60 19.85±1.30 14.46±1.20+ 16.54±2.40+Aβ+RTA-403組 15 20.10±1.20 20.20±1.10 13.13±1.40● 12.11±1.80●

2.3 六組小鼠生理生化指標(biāo)比較

小鼠的體重、尿量和血糖：Nrf2基因敲除組與WT組相比，顯著降低（P＜ 0.01），Aβ組與WT組相比，明顯降低（P＜ 0.05）。WT+ RTA-403組與WT組相比，幾乎無變化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403組與Nrf2基因敲除組相比，無顯著變化（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403組與Aβ組相比較，明顯升高（P＜ 0.05），見表2。

表2 六組小鼠生理生化指標(biāo)比較（±s）

表2 六組小鼠生理生化指標(biāo)比較（±s）

注 體重：■與◆比較，t=8.839，P=0.0001 ＜ 0.01；▲與◆比較，t=-8.361，P=0.0001 ＜ 0.01；×與◆比較，t=1.313，P=0.210 ＞ 0.05；+與■比較，t=0.670，P=0.514 ＞ 0.05；●與▲比較，t=5.714，P=0.0001 ＜ 0.01.尿量：■與◆比較，t=7.788，P=0.0001 ＜ 0.01；▲與◆比較，t=4.005，P=0.001 ＜ 0.05；×與◆比較，t=0.630，P=0.539 ＞ 0.05；+與■比較，t=0.427，P=0.676 ＞ 0.05；●與▲比較，t=4.904，P=0.0001 ＜ 0.01。血糖：■與◆比較，t=3.323，P=0.005 ＜ 0.01；▲與◆比較，t=1.410，P=0.001 ＜ 0.05；×與◆比較，t=0.937，P=0.365 ＞ 0.05；+與■比較，t=1.338，P=0.202 ＞ 0.05；●與▲比較，t=2.265，P=0.040 ＜ 0.05

組別 n 體重（g） 尿量（ml/d） 血糖（mmol/L）WT組 15 33.08±2.41◆ 10.15±2.01◆ 7.83±2.59◆Nrf2基因敲除組 15 24.05±2.59■ 5.31±2.22■ 6.05±2.67■Aβ組 15 25.12±2.37▲ 5.78±4.02▲ 5.32±1.65▲WT+RTA-403組 15 32.89±2.61× 10.08±4.31× 7.01±2.39×Nrf2基因敲除+RTA-403組 15 25.22±2.73+ 5.97±4.08+ 6.38±2.41+Aβ+ RTA-403組 15 31.43±2.36● 8.32±3.05● 6.98±2.31●

3 討論

水迷宮實驗Nrf2基因敲除組潛伏期長于WT組，Aβ組潛伏期長于WT組；Y迷宮實驗第6周和第8周的錯誤次數(shù)，Nrf2基因敲除組與WT組相比，明顯增多，Aβ組與WT組相比，明顯變多；小鼠的體重、尿量和血糖，Nrf2基因敲除組與WT相比，顯著降低，Aβ組與WT模型組相比，明顯降低，均提示Nrf2基因敲除組和Aβ組的小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能受到了損傷，Nrf2基因缺失與AD有關(guān)聯(lián)。

水迷宮實驗WT+RTA-403組相對于WT組潛伏期無明顯變化；Y迷宮實驗第6周和第8周的錯誤次數(shù)，WT+RTA-403組與WT組相比，無明顯變化；小鼠的體重、尿量和血糖，WT+RTA-403組與WT組相比較，幾乎無變化，均提示可能是由于WT組小鼠本身認(rèn)知功能沒有受損，給予RTA-403不會對小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為產(chǎn)生明顯影響。

水迷宮實驗Nrf2基因敲除+RTA-403組相對于Nrf2基因敲除組潛伏期無明顯縮短；Y迷宮實驗第6周和第8周的錯誤次數(shù)，Nrf2基因敲除+RTA-403組與Nrf2基因敲除組相比，無明顯變化；小鼠的體重、尿量和血糖，Nrf2基因敲除+RTA-403組與Nrf2基因敲除組相比，無顯著變化，均提示可能是小鼠的Nrf2基因敲除后，Nrf2激活劑RTA-403無從發(fā)揮神經(jīng)保護及抗AD的作用。

水迷宮實驗Aβ+RTA-403組相對于Aβ組潛伏期顯著縮短；Y迷宮實驗第6周和第8周的錯誤次數(shù)，Aβ+RTA-403組與Aβ組相比，明顯減少；小鼠的體重、尿量和血糖，Aβ+RTA-403組與Aβ組相比，明顯升高，均提示RTA-403有一定的抗AD的藥效。

綜上所述，可以推測Nrf2激活劑RTA-403能顯著改善Aβ組小鼠的行為學(xué)習(xí)能力，對于WT組和Nrf2基因敲除組小鼠無明顯影響，提示Nrf2通路可作為AD治療的研究方向，Nrf2激活劑RTA-403能夠使AD小鼠的認(rèn)知功能得到改善。