核桃開花相關(guān)基因JrSOC的克隆及其在開花中的作用分析

柴 念

（武漢市龜山風(fēng)景管理，湖北 武漢 430050）

1.研究的目的和意義

核桃（Juglans regia L）是胡桃科核桃屬落葉落果喬木，分早實(shí)核桃與晚實(shí)核桃兩大類群。早、晚實(shí)核桃是核桃分類中的兩大類群。由于晚實(shí)核桃播種結(jié)果需要10多年時(shí)間，嚴(yán)重影響了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。如何縮短幼年期，促進(jìn)早熟是核桃研究者難以解決的問題。

自然條件下，核桃的雌花在成熟期必須經(jīng)具有活力的花粉粒傳送到雌蕊柱頭上完成授精，才能發(fā)育成果實(shí)。不同核桃品種的雌雄花花期相遇及花粉親和性，是配置授粉樹、提高核桃產(chǎn)量的重要研究?jī)?nèi)容。通過對(duì)模式植物擬南芥的多年研究，已知MADS-box基因家族在開花時(shí)間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。其中的Supperssor of overexpression of CO基因是開花途徑的整合子，在四種開花途徑中受調(diào)控（陳方芳等 2009）。研究表明，SOC是一種多功能蛋白，主要調(diào)節(jié)開花時(shí)間，但也調(diào)節(jié)花型和花分生組織發(fā)育（Liu et al., 2009; Koornneef et al.,1998; Hepworth et al., 2002）。SOC基因與許多其他基因蛋白相互作用，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。

本研究對(duì)核桃的SOC基因進(jìn)行了克隆和同源性分析，利用qRT-PCR技術(shù)分析了SOC基因在植物不同部位和不同階段的具體表達(dá)情況，為分子育種研究和高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

2.選題依據(jù)

花是植物最重要的經(jīng)濟(jì)器官?；ɑ艿陌l(fā)育受到環(huán)境因素影響，本質(zhì)上其實(shí)是環(huán)境因素在影響基因調(diào)控?；ㄆ鞴傩纬芍苯佑绊懝麑?shí)產(chǎn)量。從現(xiàn)有的文獻(xiàn)來看，對(duì)在核桃開花中起重要作用的SOC基因的研究很少。本研究將對(duì)核桃SOC基因進(jìn)行功能分析，為進(jìn)一步的克隆核桃開花同源基因奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步解釋木本植物開花相關(guān)機(jī)制。

3.技術(shù)路線及擬解決問題

3.1 擬解決問題

本研究利用分子生物學(xué)的技術(shù)手段研究核桃內(nèi)開花基因的功能和作用，以期從分子水平揭示核桃早實(shí)特性的機(jī)理。

3.2 技術(shù)路線

4.核桃JrSOC基因的克隆及序列分析

4.1 試驗(yàn)材料

以香玲嫁接苗葉片為供試材料，在四月中旬核桃苗發(fā)芽時(shí)，采取新鮮綠色的核桃葉片。

4.2 試驗(yàn)藥品

CTAB、硼砂、醋酸、LiCL3、NaCL、水飽和酚、巰基乙醇、氨芐青霉素、氯仿、無水乙醇購(gòu)于楊陵化玻站。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNase1試劑、T4連接酶、膠回收試劑盒均購(gòu)于TaKaRa寶生物公司；DEPC處理水、DNAMarker（DL500、2000）、Loadding buffer均購(gòu)自小白生物科技有限公司。

4.3 試劑的配制

4.3.1 RNA提取液。

4.3.2 LiCL3試劑。

4.3.3 NaAc試劑。三種試劑均需要高壓滅菌后方可使用。

4.3.4 TAE緩沖液。

4.3.5 瓊脂糖凝膠。

4.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

振蕩儀、液氮、研缽、小藥匙、移液槍與槍頭、1.5ml離心管、離心機(jī)、PCR儀、水浴鍋、高壓滅菌鍋、鑷子、電子天平、廢液缸、橡膠手套、玻璃棒、微波爐、電泳槽、制冰機(jī)等。

4.5 核桃JrSOC家族基因的序列特征

以“Supperssor of overexpression of CO”為關(guān)鍵詞在核桃轉(zhuǎn)錄組cDNA序列庫(kù)中檢索到幾個(gè)SOC基因序列，比較分析軟件不同基因的結(jié)構(gòu)特征。使用ORF查找程序確定每個(gè)基因的開放閱讀框，用以O(shè)RF基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行菌液PCR，回收產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，出來正確條帶的目的基因序列經(jīng)菌液測(cè)序證實(shí)。

4.6 總 RNA 的反轉(zhuǎn)錄即 cDNA 的合成

使用Takara公司的試劑盒，按說明書操作，反轉(zhuǎn)錄得到核桃葉片的cDNA。

4.7 JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3 基因的擴(kuò)增

按照J(rèn)rSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3 基因序列設(shè)計(jì)引物，用其進(jìn)行菌液PCR。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測(cè)后，對(duì)于出現(xiàn)正確條帶使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

4.8 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定

4.8 1 PCR純化后產(chǎn)物與載體連接。

4.8.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

4.8.3 隨機(jī)選擇幾個(gè)單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定是否為陽性。

用凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，用甘油保存菌液PCR與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度一致的產(chǎn)物于冰箱零下二十?dāng)z氏度。送去公司測(cè)序后序列比對(duì)合格的菌液提取質(zhì)粒，保存?zhèn)溆?，為接下來的基因結(jié)構(gòu)分析做準(zhǔn)備。

5.結(jié)果與分析

在核桃轉(zhuǎn)錄組中獲得了JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3蛋白家族基因的序列，通過多序列比對(duì)分析、BLAST、進(jìn)化分析，對(duì)這些蛋白的序列特征進(jìn)行了初步分析。得到以下結(jié)論：

這三個(gè)基因的序列特征是不同的?；虻娜L(zhǎng)是不同的。JrSOC1-1基因的序列長(zhǎng)度為576bp，理論等電點(diǎn)為5.21，編碼蛋白的分子量為22.37kd，氨基酸數(shù)為188；JrSOC1-2基因的序列長(zhǎng)度為626bp，理論等電點(diǎn)為9.10，編碼蛋白的分子量為24.02kd，氨基酸數(shù)分別為208；JrSOC3基因的序列長(zhǎng)度為699bp，理論等電點(diǎn)為9.00，編碼蛋白的分子量為26.77kd，氨基酸數(shù)為232。

6.核桃JrSOC基因過量表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化擬南芥

6.1 試驗(yàn)內(nèi)容

核桃JrSOC基因表達(dá)載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；擬南芥植株的種植。

6.2 目的基因JrSOC表達(dá)載體構(gòu)建

通過分析JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因的CDS序列，選擇Sal I和Xba I為雙酶切位點(diǎn)，和目標(biāo)表達(dá)載體pCAMBIA2300-35SN一起進(jìn)行雙酶切，回收片段用T4連接酶連接，最后成功構(gòu)建JrSOC表達(dá)載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3。將表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，并轉(zhuǎn)入到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，分別用其特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

6.3 JrSOC基因超表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因陽性檢測(cè)

采用蘸花轉(zhuǎn)化法將已構(gòu)建完成的JrSOC超表達(dá)載體導(dǎo)入受體材料野生型擬南芥中，收獲T0代種子并繼續(xù)在含KANA的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，如圖（6-1）所示。

圖6-1 篩選后得到的T1代幼苗與野生型擬南芥

為了確定JrSOC基因是否成功導(dǎo)入擬南芥中，提取T1代擬南芥幼苗幼葉的DNA，采用特異引物進(jìn)行PCR鑒定。圖（6-2）為T1代轉(zhuǎn)基因部分植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)了合適位置的清晰條帶，表明轉(zhuǎn)基因植株能檢測(cè)出大小一樣的基因片段，說明這些幼苗為JrSOC的陽性個(gè)體。

圖6-2 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA的PCR檢測(cè)鑒定

觀察統(tǒng)計(jì)T1代植株中優(yōu)良長(zhǎng)勢(shì)的30株轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達(dá)植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了10天，野生型植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了14天，轉(zhuǎn)基因植株開花時(shí)間明顯早于野生型植株，猜測(cè)JrSOC基因可能會(huì)提早開花。

圖6-3 JrSOC基因過表達(dá)擬南芥T1植株表型

6.4 結(jié)論

將構(gòu)建過的表達(dá)載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3分別轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥中，收取T0代種子，抗生素篩選后得到抗性植株，提起抗性植株葉片的DNA經(jīng)PCR檢測(cè)，最終得到T1代擬南芥共37株。觀察統(tǒng)計(jì)T1代植株中優(yōu)良長(zhǎng)勢(shì)的30株轉(zhuǎn)基因植株的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達(dá)植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了10天，野生型植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了14天，轉(zhuǎn)基因植株開花時(shí)間明顯早于野生型植株，猜測(cè)JrSOC基因可能會(huì)提早開花。

7.結(jié)論

7.1 提取“香玲”葉片總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆出JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因，連接載體pCambia2300、轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞、菌落PCR后進(jìn)行測(cè)序。利用生物學(xué)分析軟件對(duì)JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果如下：JrSOC1-1基因的序列長(zhǎng)度為576bp，理論等電點(diǎn)為5.21，編碼蛋白的分子量為22.37kd，氨基酸數(shù)為188；JrSOC1-2基因的序列長(zhǎng)度為626bp，理論等電點(diǎn)為9.10，編碼蛋白的分子量為24.02kd，氨基酸數(shù)分別為208；JrSOC3基因的序列長(zhǎng)度為699bp，理論等電點(diǎn)為9.00，編碼蛋白的分子量為26.77kd，氨基酸數(shù)為232。

7.2 構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥觀察統(tǒng)計(jì)T1代植株中長(zhǎng)勢(shì)較好的30株轉(zhuǎn)基因植株的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達(dá)植株開花時(shí)間明顯早于野生型，推測(cè)SOC基因與植株提早開花有關(guān)。

8.討論

通過構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3，導(dǎo)入受體材料野生型擬南芥后觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株開花時(shí)間明顯早于野生型植株，猜測(cè)JrSOC基因可能會(huì)提早開花，說明SOC1-1、SOC1-2和JrSOC3對(duì)于核桃的早實(shí)具有非常重要的作用。可推測(cè)，將這3個(gè)基因作為今后提升核桃早實(shí)率的基因之一。