滇丹參與丹參有效成分含量的差異

田紅彥， 飛進(jìn)強(qiáng)， 鄒 轉(zhuǎn)， 徐紹忠

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

0 引言

【研究意義】丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]，是歷版《中華人民共和國(guó)藥典》收載中藥丹參的唯一的基源植物。歷版《中國(guó)藥典》收載的丹參藥材均來源于唇形科鼠尾草屬植物丹參一種，實(shí)則全國(guó)作丹參入藥還有白花丹參、南丹參、甘西鼠尾、褐毛甘西鼠尾和云南鼠尾草等[2]。滇丹參(SalviayunnanensisC. H. W. Wright)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)多年生草本植物，在《中國(guó)植物志》上又名云南鼠尾草、丹參、小丹參、紫丹參、山檳榔、小紅參、小紅黨參、小紅草烏、小檳榔、紫參、奔馬草和朱砂理肺散等[3-5]。滇丹參與著名中藥丹參同屬，且具有與丹參相似的藥理活性[6]，往往作為丹參的代用品使用[5-7]。滇丹參主要分布于云南、四川和貴州等地。滇丹參作為藥用植物首載于《滇南本草》[8]，已有悠久的歷史，《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》[9]也將其作為地方藥材收錄其中，其作用主要為活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜止痛、除煩安神、活血通經(jīng)、祛瘀止痛和清心除煩等療效，主要用于治療冠心病和心腦血管疾病等[10-13]，民間用于胸痹心痛等痛癥，已有數(shù)百年歷史。滇丹參在云南地區(qū)具有悠久的使用歷史，分布廣，資源豐富，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，但由于長(zhǎng)期野生采挖，導(dǎo)致滇丹參的野生種群減少，野生資源瀕臨滅絕。目前，國(guó)產(chǎn)栽培丹參因長(zhǎng)期采用無性繁殖，品種嚴(yán)重退化，商品質(zhì)量和產(chǎn)量極不穩(wěn)定，已成為國(guó)產(chǎn)丹參出口創(chuàng)匯和生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)研究的“瓶頸”[14]。而人工種植在一定程度能解決資源短缺，采用規(guī)范化的人工種植能在保證藥效的前提下保護(hù)野生資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藥材有效成分含量的高低是衡量其品質(zhì)最重要的標(biāo)準(zhǔn)。有效成分的確立決定了藥材相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的確立[15]，多年來對(duì)于丹參類藥材，多用丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參素和丹酚酸B等成分的含量評(píng)價(jià)其品質(zhì)。高效液相色譜法(HPLC)是目前含量測(cè)定中成熟并常用的方法。周曉麗等[16]采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)本草文獻(xiàn)記載的5個(gè)道地產(chǎn)區(qū)和3個(gè)非道地產(chǎn)區(qū)的丹參進(jìn)行丹參素鈉、丹參酮ⅡA和隱丹參酮含量的測(cè)定，證明了文獻(xiàn)記載的丹參道地產(chǎn)區(qū)的合理性，為道地藥材的研究奠定基礎(chǔ)。施天慧等[17]用高效液相法和紫外分光光度法對(duì)7種云南鼠尾草和1個(gè)變種的丹參酮類和丹酚酸類成分進(jìn)行測(cè)定，為滇丹參和丹參的品質(zhì)評(píng)價(jià)和資源利用提供了科學(xué)依據(jù)。【研究切入點(diǎn)】目前我國(guó)對(duì)滇丹參、丹參的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理活性方面，對(duì)種質(zhì)資源的收集，引種馴化后化學(xué)含量之間關(guān)系的研究尚屬空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高效液相色譜法對(duì)人工馴化后滇丹參與丹參有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，并比較二者的有效成分含量，為丹參雜交品種的親本選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 丹參 滇丹參，來自云南蒙自地區(qū)；丹參，引種自河南。均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材研究所提供。

1.1.2 試劑 乙腈磷酸色譜純、甲醇色譜純等，常規(guī)化學(xué)試劑均購(傲雪商貿(mào)，昆明)；標(biāo)準(zhǔn)品：丹參酮ⅡA(CHB160919)HPLC≥98%，丹參酮Ⅰ(CHB160922) HPLC≥98%，隱丹參酮(CHB180814) HPLC≥98%，丹酚酸B(CHB171015) HPLC≥98%，生產(chǎn)廠家克洛瑪生物(成都)。

1.1.3 儀器 ZA100R3電子天平，上海贊維衡器有限公司生產(chǎn)；純水機(jī)，ELGA LaBWater(U.K.)生產(chǎn)；Aglient1260高效液相色譜儀，安捷倫科技中國(guó)分公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 丹參樣品。對(duì)種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地的生長(zhǎng)12～15個(gè)月的滇丹參與丹參，采挖后考查植物性狀后，烘干，打成粉末，過40目篩。根據(jù)產(chǎn)量性狀(根鮮重)對(duì)122株滇丹參和25株丹參進(jìn)行抽樣，樣品包括30份滇丹參和20份丹參(表1)。

表1 滇丹參與丹參高效液相抽樣檢測(cè)的樣本

2) 丹參酮類含量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品1.07 mg、丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品0.50 mg和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品1.11 mg，分別裝入100 mL容量瓶中，然后加入80%甲醇溶解，最終配置成終濃度為丹參酮Ⅰ0.012 5 mg/mL，隱丹參酮0.107 mg/mL，丹參酮ⅡA 0.166 5 mg/mL的儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱備用。

3) 丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品1.07 mg，加入80%甲醇稀釋定容，即配置成終濃度為1.07 mg/mL的儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱備用。

4) 丹參酮類樣品溶液制備。選取滇丹參高、中、低產(chǎn)，各抽樣10份，丹參高、中產(chǎn)抽樣各10份，共計(jì)50份樣品。5份材料分別稱取5 g研磨打粉，粉末過40目篩，精密稱取0.06 g，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇溶液溶解定容，超聲波溶解30 min，靜置30 min，1 mL注射器吸取上清液，用0.22 μm尼龍網(wǎng)濾膜過濾，裝于上樣瓶中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5) 丹酚酸B樣品溶液制備。選取滇丹參高、中、低產(chǎn)，各抽樣10份，丹參高、中產(chǎn)抽樣各10份共計(jì)50份樣品。5份材料各稱取5 g研磨打粉，粉末過40目篩，精密稱取0.03 g，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入80%的甲醇溶液溶解定容，超聲波溶解30 min，靜止30 min，1 mL注射器吸取上清液，用0.22 μm尼龍網(wǎng)濾膜過濾，裝于上樣瓶中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

1) 丹參酮類含量。色譜柱型號(hào)：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)色譜條件見表2。檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

表2 丹參酮類色譜條件

2) 丹酚酸B含量。色譜柱型號(hào)：Agilent SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，色譜條件見表3。檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

表3 丹酚酸B色譜條件

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL和5.0 μL進(jìn)樣，按確定的色譜條件進(jìn)行分析，得到峰面積圖，用Excel 2010以進(jìn)樣量的梯度為橫坐標(biāo)(x)，對(duì)應(yīng)進(jìn)樣量的相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，構(gòu)建線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參活性成分標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程

從表4可知，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹酚酸B的線性回歸方程的R2均為1，表明，進(jìn)樣量(x)與檢出峰面積(Y)存在良好線性關(guān)系。該檢測(cè)方法對(duì)丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹酚酸B的測(cè)定范圍分別為0.012 5～0.625 0 μg、0.010 7～0.535 0 μg、0.016 7～0.832 5 μg和0.107 0～5.350 0 μg。

表4 丹參活性成分標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程

2.2 丹參酮類的含量及其分布

2.2.1 丹參酮類的含量 從表5可知，滇丹參的丹參酮Ⅰ的含量為0.037 3%，略高于丹參(0.035 8%)，但二者沒有顯著性差異。丹參的隱丹參酮含量為0.035 6%，顯著高于滇丹參(0.019 9%)。滇丹參的丹參酮ⅡA含量為0.137 5%，顯著高于丹參(0.095 5%)。總體上，滇丹參的丹參酮總量(0.194 7%)略高于丹參(0.166 9%)，但二者無顯著差異。參考2020版《中華人民共和國(guó)藥典》“干燥品丹參中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA三者的總含量不得低于0.25%”的規(guī)定，滇丹參與丹參在丹參酮類含量上均未達(dá)到藥典的規(guī)定。

表5 滇丹參與丹參的丹參酮類含量

2.2.2 丹參酮類含量的分布 檢測(cè)結(jié)果表明，30株滇丹參的丹參酮類含量為0.03%～0.74%，其中，24株株的含量為集中在0.17%～0.31%，占測(cè)量總數(shù)的80%；丹參酮類含量≥0.25%的有8株，占測(cè)量總量的26.7%，其中含量最高的是DDS075號(hào)樣本。20株丹參的丹參酮類含量為0.05%～0.35%，其中，17株樣本的含量集中在0.13%～0.28%，占測(cè)量總數(shù)的85%；丹參酮類含量≥0.25%的有4株，占測(cè)量總量的20%，其中含量最高的DS021號(hào)樣本。

2.3 丹酚酸B含量

20株丹參的丹酚酸B平均含量為5.49%，極顯著高于滇丹參的丹酚酸B平均含量(3.17%)。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定：干燥品丹參中丹酚酸B的含量不能低于3.0%。因此，總體看，滇丹參與丹參的丹酚酸B含量均達(dá)到藥典的規(guī)定。從丹酚酸B含量分布看，30株滇丹參的丹酚酸B含量為1.78%～5.49%，其中25株樣本的含量集中在2.52%～4.01%，占測(cè)量總數(shù)的83.3%；丹酚酸B含量≥3.0%的有21株，占測(cè)量總量的70.0%，其中DDS117號(hào)樣本的含量最高。丹參中丹酚酸B含量為3.44%～8.68%，其中有18株樣本的含量為4.75%～7.37%，占測(cè)量總數(shù)的90.0%；丹酚酸B含量≥3.0%的有20株，100.0%符合藥典規(guī)定，其中DS05號(hào)樣本的含量最高，其丹酚酸B含量為8.68%。

3 討論

有效成分含量是否達(dá)標(biāo)是對(duì)藥用植物品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定對(duì)丹參類藥材水溶性化合物丹酚酸B的含量不低于3%，脂溶性化合物丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮三者的總含量不低于0.25%。在脂溶性含量方面，總體看，滇丹參與丹參(引種自河南)在丹參酮類含量上均未達(dá)到藥典的規(guī)定。與飛進(jìn)強(qiáng)等[18]的試驗(yàn)結(jié)果相似，即在露天環(huán)境條件下，滇丹參和丹參的丹參酮類化合物沒達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。從丹參酮類含量分布看，30株滇丹參中丹參酮類含量≥0.25%的數(shù)量有8株，占測(cè)量總量的26.7%，其中含量最高的是DDS075號(hào)樣本，其丹參酮類含量為0.74%；20株丹參中丹參酮類含量≥0.25%的數(shù)量有4株，占測(cè)量總量的20%，含量最高的DS021號(hào)樣本，其丹參酮類含量為0.354%，同一水平下滇丹參材料合格率較高。在水溶性含量方面，丹參(引種自河南)的丹酚酸B含量極顯著高于滇丹參?？傮w看，滇丹參與丹參在丹酚酸B含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020版規(guī)定；30株滇丹參有21株的丹酚酸B含量≥3.0%，占測(cè)量總量的70.0%，其中含量最高的是DDS117號(hào)樣本，其丹酚酸B含量為5.49%；而20株丹參的丹酚酸B含量全部≥3.0%，100.0%符合藥典規(guī)定，其中含量最高的是DS05號(hào)樣本，其丹酚酸B含量為8.68%。表明，同一水平下丹參材料的合格率高，品質(zhì)好。

綜合看，滇丹參與丹參在丹參酮類含量上均未達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定，丹參在丹酚酸B含量方面顯著優(yōu)于滇丹參，與飛進(jìn)強(qiáng)等[18-19]的結(jié)果差異較大，究其原因可能與人工馴化過程有一定關(guān)系，文鳳娟等[19]采集的樣本為純野生的材料，飛進(jìn)強(qiáng)等[18]所栽培的為野生擴(kuò)繁種源，而該研究材料為野生資源結(jié)實(shí)種子播種栽培。

4 結(jié)論

滇丹參與丹參(引種自河南)的丹參酮類含量均未達(dá)到藥典的規(guī)定；滇丹參單株達(dá)標(biāo)率為26.7%，最高含量為0.74%；丹參單株達(dá)標(biāo)率為20%，最高含量為0.354%。丹參的丹酚酸B含量極顯著高于滇丹參。滇丹參與丹參的丹酚酸B含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020版規(guī)定；滇丹參單株達(dá)標(biāo)率為70.0%，最高含量為5.49%；丹參為100.0%合格，最高含量為8.68%，同水平下丹參材料合格率高，品質(zhì)好。