單寧對綿羊抗氧化能力及免疫性能的影響

解湧芳，李大彪，牛曉雨，朱壽謙，王敬堯，麗 麗

（內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

檸條在內蒙古、陜西等地分布廣泛，起到防風固沙和保持水土的作用，營養(yǎng)價值較高，但其含有單寧，限制了檸條的開發(fā)利用。單寧廣泛存在于水果、豆類、灌木類等植物中，是植物由碳水化合物代謝衍生出來的具有保護性的物質。飼糧中適量的單寧不僅能提高反芻動物過瘤胃蛋白和氨基酸的數量，還可抑制臌脹病發(fā)生，提高動物生產性能。單寧分子中含有大量的羥基和羰基，是較強的抗氧化劑和活性氧自由基清除劑。陳賽娟等研究發(fā)現在獺兔飼糧中添加適量的單寧酸可以增強抗氧化和免疫能力。Holdеrnеss 等研究發(fā)現，知母寧與螺旋藻的抗氧化作用強于單寧酸，而知母寧和單寧酸的清除自由基作用強于螺旋藻。金亞倩等在綿羊飼糧中添加葡萄皮渣（含單寧），結果表明適宜劑量的葡萄皮渣可提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性和總抗氧化能力（T-AOC），降低丙二醛（MDA）含量。目前，國內外關于單寧對動物抗氧化和免疫能力影響的報道大多以葡萄皮渣、茶葉渣等副產物為研究對象，而木本化飼料資源檸條來源的單寧對反芻動物抗氧化和免疫性能的研究報道較少。本課題組前期研究發(fā)現飼糧中含有2%和4%的單寧對綿羊的日增重無顯著影響，本試驗旨在研究飼糧中不同水平單寧對綿羊免疫及抗氧性能的影響，為檸條等富含單寧的非常規(guī)飼料資源的開發(fā)利用，以及單寧在畜牧業(yè)生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗選用結莢期的檸條作為飼糧單寧的來源，檸條購自內蒙古百瑞草業(yè)有限公司。

1.2 試驗設計及日糧 試驗選取15 只健康狀況良好、體重為45 kg 左右、1～1.5 周歲杜蒙雜交羯羊，隨機分為3 組，每組5 只。對照組飼糧中不含單寧，2%單寧組飼糧中單寧含量為2%，4% 單寧組飼糧中單寧含量為4%。試驗動物按照維持需要的1.2 倍飼養(yǎng)，按照《動物營養(yǎng)參數與飼養(yǎng)標準》（2010）配制飼糧。主要化學成分詳見表2，參照王敬堯（2019）的方法測定。預飼期14 d，正試期75 d。試驗動物單籠飼養(yǎng)，自由飲水，試驗開始前統(tǒng)一驅蟲。每天09:00 和17:00 各飼喂1 次。3 組飼糧按照等能等氮原則配制，飼糧精粗比4:6，加工成全混合顆粒。飼糧組成及營養(yǎng)成分見表2。

表1 檸條中的營養(yǎng)成分和單寧含量（風干基礎）

表2 試驗飼糧組成和營養(yǎng)成分（干物質基礎）

1.3 樣品采集 在正試期第15 天、第45 天和第75 天晨飼前，用真空采血管對每只羊進行頸靜脈采血。用無抗凝采血管和抗凝采血管分別采集10～20 mL 血液，傾斜靜置30 min 后，3 500 r/min 離 心10 min。吸取無抗凝采血管離心后的上清液，制備血清，用于血清免疫及抗氧化指標的測定；吸取抗凝采血管離心后的血清和血漿之間的淋巴細胞，放于凍存管中，加1 mL 裂解液混勻后然后暫存于液氮中，之后放置于-80℃冰箱冷凍保存，用于抗氧化及免疫相關基因表達量的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血清抗氧化指標測定 MDA、T-AOC、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、T-SOD、過氧化氫酶（CAT）、硫氧還原蛋白酶（TrxR）活性的測定參照試劑盒說明書進行，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。測定儀器為分光光度計（1900PCS）和全功能酶標儀（EL-X800，Bio-TEK）。

1.4.2 血清免疫指標測定 免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM） 、白介素-1（）、白介素-6（）、腫瘤壞死因子-（-）含量采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定，參照試劑盒說明書的步驟進行，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。測定儀器為分光光度計（1900PCS）和全功能酶標儀（EL-X800，Bio-TEK）。

1.4.3 血清淋巴細胞中抗氧化及免疫相關基因表達量的測定 用淋巴細胞分離液分離血液中的淋巴細胞，采用Trizol 試劑盒（TaKaRa）從淋巴細胞提取總RNA，并測定總RNA 的純度 和濃度。用Primе ScriptRT 試劑試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA ；步驟為：37℃、15 min ；85℃、5 s，并保存于-80℃用于實時熒光定量PCR。采用SYBR Grееn II 實時定量RT-qPCR 技術對綿羊血液淋巴細胞中、核轉錄因子-B（）、、轉錄因子NFE2 相關因子（）等基因的相對表達量進行測定，以作為內參基因。各基因表達量用2值表示，同一基因平行測定3 次。目的基因和內參基因的引物序列見表3。

表3 基因及引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數據經Excеl 2013 進行初步整理，實時熒光定量PCR 的試驗結果采用2法進行相對定量分析，運用SAS 9.2 軟件的ANOVA 過程進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan′s 法。以<0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 單寧對綿羊血清抗氧化指標的影響 由表4 可知，正試期第15 天，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊血清T-SOD、TrxR 和GSH-Px 濃度高于對照組（<0.05）；2%單寧組和4%單寧組綿羊血清T-AOC 有高于對照組的趨勢（=0.060），而血清MDA 含量有低于對照組的趨勢（=0.041）；2% 單寧組綿羊血清CAT 濃度高于對照組和4%單寧組（<0.05）。

表4 檸條中的單寧對綿羊血清抗氧化指標的影響

第45 天，2% 單寧組 和4% 單寧組 綿羊血 清CAT、T-SOD 和GSH-Px 濃度高于對照組（<0.05）；2% 單寧組綿羊血清T-AOC 高于對照組和4% 單寧組（<0.05），而MDA 含量低于對照組和4% 單寧組（<0.05）；3 組綿羊血清TrxR 濃度無顯著差異。

第75 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊血清CAT、TrxR 和GSH-Px 濃高于對照組（<0.05）；2%單寧組綿羊血清T-AOC 有高于對照組的趨勢（=0.101），而MDA 含量低于對照組和4%單寧組（<0.05）；4%單寧組綿羊血清T-SOD 濃度高于對照組和2% 單寧組（<0.05）。

2.2 單寧對綿羊血清免疫指標的影響 由表5 可知，正試期第15 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊血清IgG 濃度高于對照組（<0.05），IL-1和IL-6 濃度低于對照組（<0.05）；2% 單寧組和4% 單寧組血清TNF-濃度有低于對照組的趨勢（=0.051）；2%單寧組綿羊血清IgM 濃度高于對照組和4%單寧組（<0.05）；3 組綿羊血清IgA 濃度無顯著差異（>0.05）。

表5 檸條中的單寧對綿羊血清免疫指標的影響

正試期第45 天，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊血清IgA 和IgG 濃 度高于對照組（<0.05），IL-1和TNF-濃度低于對照組（<0.05）；3 組綿羊血清IgM和IL-6 濃度無顯著差異。

正試期第 75 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊血清IgG 濃度高于對照組（<0.05）；2% 單寧組和4% 單寧組綿羊血清IgA 濃度有高于對照組的趨勢（=0.042），而TNF-濃度有低于對照組的趨勢（=0.053）；3 組綿羊血清IgM、IL-1和IL-6 濃度無顯著差異。

2.3 單寧對綿羊血清淋巴細胞抗氧化相關基因表達的影響 由表6 可知，正試期第15 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞和的mRNA 表達量高于對照組（<0.05）。

表6 檸條中的單寧對綿羊血清淋巴細胞抗氧化相關基因表達的影響

正試期第45 天，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞和的mRNA 表達量高于對照組（<0.05）；2% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞的mRNA 表達量高于對照組和4% 單寧組（<0.05）。

正試期第75 天，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞和的mRNA表達量高于對照組（<0.05）；4% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞的mRNA 表達量高于對照組和2% 單寧組（<0.05）。

2.4 單寧對綿羊血清淋巴細胞免疫相關基因表達的影響 由表7 可知，正試期第15 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞和的mRNA表達量低于對照組（<0.05）；2% 單寧組和4% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞-的mRNA 表達量有低于對照組的趨勢（=0.023）。

表7 檸條中的單寧對綿羊血清淋巴細胞免疫相關基因表達的影響

正試期第45 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞和-的mRNA 表達量低于對照組（<0.05），和的mRNA 表達量在3 組間無顯著差異。

正試期第75 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊血清淋巴細胞的mRNA 表達量低于對照組（<0.05）；2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞-的mRNA 表達量有低于對照組的趨勢（=0.026）；和的mRNA 表達在3 組間無顯著差異。

3 討 論

血清T-AOC、TrxR、CAT、GSH-Px、SOD 及MDA含量是反應機體抗氧化水平最直觀的指標。GSHPx、T-SOD、TrxR 和CAT 是機體最主要的酶促抗氧化系統(tǒng)，其主要作用是清除自由基和活性氧、防止脂質過氧化物生產，分解過氧化物，阻斷過氧化反應鏈。MDA 是脂質過氧化的最終產物，是衡量機體產生氧化損傷的重要指標。研究提出，植物多酚對機體抗氧化能力的影響機制可能與Nrf2 的表達有關。Nrf2-ARE信號通路是保護細胞免受外源性刺激和氧化損傷的主要信號通路，它能夠通過調控下游一系列II 相解毒酶活性和抗氧化基因，例如、谷胱甘肽-S-轉移酶（）基因mRNA 的表達，進而調控機體抗氧化功能。尚運之等以大鼠為試驗模型研究沒食子酸對機體抗氧化功能的影響，結果顯示，沒食子酸可提高小白鼠腦皮層組織中SOD、GSH-Px 活性，降低MDA含量，說明沒食子酸對參與到氧化應激酶促反應的相關因子都有一定的調節(jié)作用。魏海峰在糖尿病大鼠的飼糧中添加單寧酸（20 mg/kg 及30 mg/kg），發(fā)現血清和組織中的T-SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性均有增強，而MDA 含量降低。劉華偉等建立氧化應激模型，在肉兔飼糧中添加栗樹單寧，結果表明飼糧中添加栗樹單寧可以顯著提高肉兔血清SOD 和GSH-Px 的活性以及T-AOC，顯著降低血清中MDA 含量，而且添加栗樹單寧促進了肉兔肝臟組織中SOD、Cu 以及和基因表達量。陳賽娟等研究指出，在常規(guī)飼養(yǎng)條件下的肉兔飼糧中添加適量的單寧酸可提高血清和組織中 TrxR、CAT、GSH-Px 和SOD 等抗氧化酶的活性，同時也促進等抗氧化酶基因的表達。前人研究指出兒茶素沒食子酸酯可以激活Nrf2/HO-1 抗氧化信號通路，上調Nrf2 通路相關基因表達，改善組織的抗氧化能力，提高SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物（GPx）的活性，抑制NF-B 活性，降低炎癥水平，從而預防大鼠梗阻性腎病。本試驗得出，與對照組相比，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊血清CAT、GSH-Px、TrxR 和T-SOD 濃度，以及外周血淋巴細胞CAT、GPx1 和Nrf2 的mRNA 表達量均顯著升高，而血清MDA 濃度出現不同程度的降低；4% 單寧組外周血淋巴細胞SOD1 的mRNA 表達量顯著高于對照組，這與前人研究結果一致，表明飼糧中含2%和4%來源于檸條的單寧提高了綿羊的抗氧化能力。2%～4%的單寧提高綿羊抗氧化能力的原因可能是單寧激活了Nrf2/ARE 信號通路，促進Nrf2 核轉位和活化，啟動抗氧化應激一系列蛋白和酶的表達，增強細胞抗氧化應激的能力，這有待后續(xù)通過基因過表達和基因沉寂技術結合蛋白表達的測定來證實。

機體的免疫系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)相互聯(lián)系，相互影響，當機體有免疫應激反應發(fā)生時，體內的抗氧化系統(tǒng)也會隨之失衡，從而產生氧化應激反應，而NF-B 信號通路恰好是連接這2 個系統(tǒng)的重要樞紐。IgA、IgG、IgM 是動物血清中主要的免疫球蛋白，其中IgG和IgM 能夠幫助機體抵抗細菌和病毒的入侵，而且IgA具有IgG 和IgM 的免疫活性，可以促進機體呼吸道、消化道等局部黏膜的免疫應答。正常的機體產生炎癥反應的過程取決于抗炎因子（如IL-2、IL-4、IL-10）與促炎因子（如IL-6、IL-1、TNF-）之間的平衡，使其達到既能控制各種病理性損害因素，又不至于擴大炎癥反應，加重機體免疫性損害。回海勇研究表明添加單寧酸能夠顯著提高奶牛血清中IgG、IgM、IgA含量。陳云龍等對免疫功能低下的小鼠灌胃槲皮苷，結果表明槲皮苷能夠提高小鼠的IgG、IgM 含量。鄧鳳君等研究了茶多酚對大鼠脊髓損傷急性期抗炎的作用，發(fā)現給大鼠灌胃25～100 mg/kg 茶多酚能降低血清IL-1、IL-6 等炎性因子含量。葉清等在田鼠飼糧中添加1.5%、3%、5% 和8% 的植物槲皮素，結果顯示植物槲皮素濃度在5% 以內可降低炎性因子TNF-和IL-1含量。Matsumura 等研究表明，對小鼠灌胃2%的柿子單寧水解液，可下調IL-1、IL-6、TNF-等炎性因子的mRNA 表達量，從而抑制小鼠炎癥反應。李華麗等研究表明茶多酚可以降低肉雞IL-1、IL-6、TNF-以及NF-B 的mRNA 表達量。Qin 等研究發(fā)現，添加茶多酚（每天200 mg/kg BW）6 周能降低大鼠IL-1、IL-6 和TNF-的 mRNA 的表達，其糖尿病模型樣品的抗炎因子表達得到提高。本試驗得出，2%單寧組和4%單寧組綿羊血清IgG、IgA 和IgM 濃度均高于對照組，而TNF-和IL-1濃度均低于對照組，同時，2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞IL-1、TNF-和NF-B 的mRNA 表達量顯著低于對照組；第15 天，2%單寧組和4%單寧組綿羊外周血淋巴細胞IL-6 的mRNA 表達量顯著低于對照組，這與前人研究結果一致，表明單寧可通過抑制NF-B 通路下調炎性因子IL-1、TNF-的mRNA 表達量，提高綿羊的免疫能力。而第45 天和75 天，2% 單寧組和4% 單寧組綿羊外周血淋巴細胞IL-6 的mRNA 表達量有高于對照組的趨勢，但差異不顯著，這與前人研究結果不一致，其原因還有待于從蛋白表達水平等角度進行深入研究。

4 結 論

本試驗結果顯示，飼糧中含2%和4%單寧顯著提高了綿羊血清GSH-Px、CAT、TrxR、T-SOD、IgA 和IgG 濃度，顯著降低了MDA 含量和IL-1、TNF-濃度，同時顯著上調綿羊外周血淋巴細胞CAT、GPx1 和Nrf2 的mRNA 表達量，顯著下調IL-1、TNF-以及NF-B 的mRNA 表達量，表明飼糧中含2%～4% 的單寧可以提高綿羊的抗氧化和免疫能力。