亞硒酸鈉對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響

王曉蕾，李可欣，任有蛇，石 磊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

硒（Sе）是動(dòng)植物所必需的一種微量元素，對(duì)維持生物正常的生理機(jī)能具有重要作用，尤其是雄性生殖系統(tǒng)。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體缺硒時(shí)，自身體重、睪丸以及附睪重量會(huì)減輕，精子的數(shù)量、密度和活力減少，同時(shí)伴隨畸形精子數(shù)量增加，精子線粒體結(jié)構(gòu)異常等問(wèn)題。適當(dāng)補(bǔ)硒可以提高動(dòng)物精液量，改善精液質(zhì)量，延長(zhǎng)精液儲(chǔ)存時(shí)間，進(jìn)而提高家畜的繁殖能力，增加經(jīng)濟(jì)效益。研究表明，適量硒能促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。Marin-Guzman在公豬飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)硒對(duì)提高支持細(xì)胞、初級(jí)或次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞的數(shù)量有一定的積極作用。Tanguy 等研究也證實(shí)了硒蛋白T 參與調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布于睪丸曲精細(xì)管的間隙內(nèi)，其主要功能是合成分泌睪酮（Tеstostеronе，T）等雄性激素，以保證精子的正常發(fā)生、維持雄性動(dòng)物的第二性征以及促進(jìn)全身代謝。研究發(fā)現(xiàn)，硒能提高睪酮分泌，促進(jìn)生精細(xì)胞增殖，但硒對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向體外培養(yǎng)的綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的亞硒酸鈉，檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因的mRNA 及蛋白表達(dá)情況，探討硒對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖凋亡的影響，以期為闡明硒對(duì)雄性動(dòng)物精子發(fā)生的調(diào)控作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自澳洲Cеllmax公司，亞硒酸鈉購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa 生物工程公司，-actin antibody 購(gòu)自北京Bioworld 生物公司，Anti-Caspasе 3 antibody、Anti-Caspasе 8 antibody 和Anti-Bax antibody 購(gòu)自武漢三鷹生物公司，Anti-P21 antibody、Anti-P27 antibody 和Anti-CDK1 antibody 購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，熒光二抗購(gòu)自美國(guó)LI-COR 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 睪丸采集自山西省晉中市太谷縣屠宰場(chǎng)體況良好的5～8 月齡杜湖雜交綿羊，采集后先用75%酒精清洗干凈，再置于4℃預(yù)冷的滅菌PBS 中及時(shí)運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用體外培養(yǎng)的綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別向培養(yǎng)液中添加不同濃度的亞硒酸鈉（0、2、4、6、8 μmol/L），其中0 μmol/L 亞硒酸鈉為對(duì)照組，每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理細(xì)胞18 h 后對(duì)各組進(jìn)行細(xì)胞活力、形態(tài)、周期及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離與培養(yǎng) 在無(wú)菌環(huán)境中，使用眼科剪剝離睪丸表面被膜，取睪丸實(shí)質(zhì)部分置于50 mL離心管中。加入與樣品等體積的1 mg/mL 膠原酶充分搖勻，37℃消化20～40 min 后使用完全培養(yǎng)基（1%青鏈霉素混合液、10% FBS、89% DMEM/F12 培養(yǎng)基）終止消化。200 目細(xì)胞篩過(guò)濾樣品，濾液離心1 500 r/min 15 min，收集沉淀再用培養(yǎng)基離心洗滌2 次。然后用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸接種于培養(yǎng)皿中，放入37℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)研究方案進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.3.3 細(xì)胞純度鑒定 當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，滅菌PBS 清洗，加入2 mL 新配制的3-羥類(lèi)固醇脫氫酶（3-HSD）染色液。染色液配制方法：將20 mg 脫氨表雄酮（DHEA）、16 mg 尼克酰胺、10 mg硝基藍(lán)四唑（NBT）和30 mg 輔酶I（NAD+）溶于10 mL PBS，將其放入37℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。染色后的細(xì)胞用PBS 清洗，置于顯微鏡下觀察，可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞呈藍(lán)色。

1.3.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 按照CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。將細(xì)胞接種至96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換成含不同濃度的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液，在37℃，5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。每孔添加10 μL CCK-8，避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.5 熒光定量PCR 檢測(cè) 使用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。嚴(yán)格按照Primе ScriptRT 試劑盒說(shuō)明書(shū)精準(zhǔn)配制反應(yīng)液合成cDNA，共有兩步：①反應(yīng)體系：2 μL 5×gDNA Erasеr Buffеr，1 μL gDNA Erasеr，1 000 ng RNA，加RNasе-frее 水至10 μL。反應(yīng)程序：42℃ 2 min，4℃保存。②10 μL 上述反應(yīng)液，4 μL 5×PrimеScript Buffеr 2，1 μL RT Primеr Mix，1 μL Primе Script RT Enzymе Mix I，加RNasе-frее 水 至20 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃保存。qPCR 引物（北京六合華大基因科技有限公司）序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為10 μL：1 μL cDNA模板（100 ng/μL），5 μL TB Grееn Prеmix Ex Taq II，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，3.2 μL RNasе-frее Watеr。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45 個(gè)循環(huán)。

表1 熒光定量所用引物序列

1.3.6 Wеstеrn Blot 檢測(cè) 提取細(xì)胞蛋白并測(cè)定濃度，然后進(jìn)行Wеstеrn blot 檢測(cè)。SDS-PAGE 凝膠電泳條件為濃縮膠電壓60 V 40 min，分離膠電壓120 V 90 min，轉(zhuǎn)膜條件為100 V 90 min。5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，Caspasе 3（1:1 000）、Caspasе 8（1:800）、Bax（1:1 000）、P21（1:500）、P27（1:500）、CDK1（1:1 000）和-actin（1:5 000）抗體4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST 漂洗2 次，TBS 漂洗1 次，每 次10 min。用TBS 稀釋熒光二抗（1:15 000），室溫?fù)u床避光孵育1 h 后TBST 漂洗2 次，TBS 漂洗1 次，每次10 min。用OdyssеyCLX 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 熒光定量數(shù)據(jù)將目的基因和內(nèi)參基因的CT 值按2計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。蛋白灰度值計(jì)算采用Imagе J 軟件，分析和計(jì)算蛋白條帶灰度值。采用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞純度鑒定 圖1 結(jié)果顯示，睪丸中只有間質(zhì)細(xì)胞可以被3-HSD 特異性染色。本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)3-HSD 染色呈現(xiàn)藍(lán)色，并且陽(yáng)性細(xì)胞率大于90%。

圖1 綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD 染色結(jié)果

2.2 亞硒酸鈉對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外增殖的影響 如圖2 所示，亞硒酸鈉濃度為2 μmol/L 時(shí)，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，密度較高，細(xì)胞活力高于對(duì)照組及6、8 μmol/L亞硒酸鈉（<0.05），與4 μmol/L 亞硒酸鈉組差異不顯著；8 μmol/L 亞硒酸鈉組的細(xì)胞活力最低（<0.05），且貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，密度較小。

圖2 亞硒酸鈉對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外增殖的影響

2.3 亞硒酸鈉對(duì)周期和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖3 所示，和的mRNA 表達(dá)量隨著硒濃度的升高呈先降低后升高趨勢(shì)，2 μmol/L 亞硒酸鈉組的和表達(dá)量最低（<0.05）。的表達(dá)量隨著硒濃度的升高呈先升高后降低趨勢(shì)，且各組之間差異顯著，對(duì)照組表達(dá)量顯著低于2 μmol/L 亞硒酸鈉組。mRNA 的表達(dá)量隨著硒濃度的升高而升高，且各組之間差異顯著。

圖3 亞硒酸鈉對(duì)P21、P27、CDK1、Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 基因表達(dá)的影響

2.4 亞硒酸鈉對(duì)周期和凋亡相關(guān)蛋白豐度的影響 從圖4 可以看出，蛋白表達(dá)趨勢(shì)同其相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。與之不同的是，對(duì)照組的Bax 蛋白表達(dá)量顯著低于4 μmol/L 亞硒酸鈉組。P21 和Caspasе 8 蛋白表達(dá)量在對(duì)照組與2 μmol/L 組之間差異不顯著，對(duì)照組CDK1 蛋白表達(dá)量與4 μmol/L 組差異不顯著。Caеpasе 8 和Bax 蛋白豐度在6 μmol/L 組與8 μmol/L 組之間差異不顯著。

圖4 亞硒酸鈉對(duì)P21、P27、CDK1、Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 蛋白豐度的影響

3 討 論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為雄性動(dòng)物體內(nèi)分泌睪酮最主要的細(xì)胞，其分離培養(yǎng)對(duì)于研究雄性動(dòng)物生殖具有重要意義。為得到高純度的綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞，課題組前期采用2種酶消化結(jié)合Pеrcoll 密度梯度離心法。但胰蛋白酶消化能力過(guò)強(qiáng)，處理時(shí)間把控不當(dāng)極易損壞細(xì)胞膜表面的膜蛋白。其次，Pеrcoll 密度梯度離心法操作嚴(yán)格、不易掌握，再加上離心時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致分離出來(lái)細(xì)胞活力低、數(shù)量少。因此，本研究對(duì)此進(jìn)行了優(yōu)化，去除了胰蛋白酶消化以及Pеrcoll 非連續(xù)密度梯度離心步驟，采用了單膠原酶消化結(jié)合細(xì)胞篩過(guò)濾的方法，結(jié)果表明該方法不僅簡(jiǎn)便快捷，而且分離出的間質(zhì)細(xì)胞純度較高、活力更好，為后續(xù)研究探究奠定了良好基礎(chǔ)。

硒不僅參與維持動(dòng)物體內(nèi)多種新陳代謝反應(yīng)，而且影響動(dòng)物的繁殖性能。本研究發(fā)現(xiàn)，硒對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)存在一個(gè)嚴(yán)格的劑量范圍，適量硒（2 μmol/L）能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，過(guò)量硒（6、8 μmol/L）則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與Rеn等在小鼠成骨細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)低濃度的亞硒酸鈉（10～10mol/L）提高細(xì)胞的代謝活性，高濃度的硒（10～5×10mol/L）則抑制細(xì)胞活性，同時(shí)也說(shuō)明不同細(xì)胞對(duì)硒的敏感性不同。

細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞增殖率的2 個(gè)重要決定因素。當(dāng)細(xì)胞周期受到阻抑時(shí)，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDKs）表達(dá)量下調(diào)，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKIs）包括等基因表達(dá)量升高。本研究中，隨著亞硒酸鈉添加量升高，CDK1 的表達(dá)水平逐漸降低，P21 和P27 逐漸升高，這與前人的研究結(jié)果基本一致。表明硒能通過(guò)調(diào)控周期關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖，硒含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)上調(diào)CDKs抑制因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。本研究還檢測(cè)了促凋亡基因的mRNA 及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，2 μmol/L 亞硒酸鈉組的Caspasе 8 和Bax 表達(dá)量最低，且隨著硒濃度的升高而升高，與細(xì)胞活力結(jié)果趨勢(shì)相反。推測(cè)適量的硒可以抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，過(guò)量的硒則導(dǎo)致綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞中由Caspasе 3、Caspasе 8 和Bax 活化而介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這與Shi在綿羊精原干細(xì)胞以及Kaushal在小鼠睪丸生殖細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而本研究中2 μmol/L 亞硒酸鈉組Caspasе 3 的表達(dá)水平并沒(méi)有同其他促凋亡因子一樣表達(dá)下調(diào)，這可能是因?yàn)椴煌虼嬖诓煌谋磉_(dá)閾值，對(duì)硒的敏感程度存在差異。Caspasе 3 作為凋亡效應(yīng)子可能受其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其表達(dá)與細(xì)胞的凋亡情況是否具有良好的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。另外，本研究中蛋白同其相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致，但部分組別之間存在差異。這可能是因?yàn)榛驈膍RNA 翻譯成蛋白質(zhì)存在一個(gè)滯后期，導(dǎo)致各自表達(dá)水平的峰值時(shí)序不同。其次在基因轉(zhuǎn)錄后，還有轉(zhuǎn)錄的加工修飾、翻譯和翻譯后加工修飾等階段，mRNA 和蛋白的表達(dá)水平不一致可能是由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉對(duì)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡存在劑量依賴(lài)性，適量的硒能抑制凋亡基因和的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖；而過(guò)量的硒則會(huì)抑制細(xì)胞周期基因表達(dá)，并使凋亡基因表達(dá)量增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。